腌肉中乳酸菌的分离选育

China Brewing

乳酸菌是指一群能发酵糖类产生大量乳酸的细菌的通称。在形态上可分为球菌和杆菌，

多数为革兰氏阳性、无芽胞、不运动、过氧化氢酶阴性、兼性厌氧、发酵葡萄糖能产生50%以上乳酸，广泛应用于乳制品、蔬菜及肉制品的发酵与防腐中[1]。

腌肉是湖南一种具有特色的传统食品。其传统的加工方法是采用新鲜的腹背肉，清洗后沥干表面水分，拌入食盐腌制一定的时间，再辅以料酒、生姜、大蒜等拌料，自然发酵而成。但是这种加工方法存在发酵微生物种类的安全性难以保证、生产周期长、产品品质难以控制等不足之处[2]，

因而仅限于家庭制作。本研究从腌肉中选育出发酵性能好的优良乳酸菌，旨在为研制发酵剂进行人工接种发酵，缩短生产周期，改善产品品质，推动湖南传统腌肉产业化提供理论参考。1材料与方法1.1材料

猪肉：市售，按照1.2.1中的方法制成腌肉。

培养基：MRS 培养基，过氧化氢酶试验培养基，盐还原培养基，明胶液化培养基，吲哚试验培养基，H 2S 试验培养基，pH4.5生长培养基，pH5.4乙酸盐琼脂培养基[3-5]。1.2方法

1.2.1腌肉制作及样品处理

取新鲜的腹背肉，洗净、晾干，切成300g~400g 的条状，拌上8%的食盐，加入辅料，密封，10℃发酵一定时间。再用2m/s ~3m/s 、10℃左右的空气干燥至合适水分含量。

以无菌操作，将25g 腌肉样品剪碎后放入装有225mL 无菌水的灭菌玻璃瓶内（瓶中预置适当数量的玻璃珠），振摇30min ，制成混悬液[3-4]。吸取10mL 混悬液接入50mL MRS 液体培养基中，37℃培养24h 。1.2.2分离培养及菌落形态观察

将上述菌液梯度稀释至合适浓度，涂布于含有2%碳酸钙的MRS 平板上，

其上再覆盖一层同样的培养基，于37℃培养48h 后，观察菌落形态。

乳酸菌菌落一般分布于培养基底层或中部、白色或灰白色、有光泽、圆形或针尖状，菌落周围有溶钙圈。1.2.3革兰氏染色及过氧化氢酶试验

取典型菌落进行革兰氏染色镜检，同时进行过氧化氢酶试验。凡是革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株可初步认定为乳酸菌的疑似菌株[3-4]。1.2.4菌株的纯化

将疑似菌株，继续在MRS 培养基上划线，37℃培养48h 。多次分离纯化，直至得到单菌落。纯化后的菌株进行斜面保存，备用。1.2.5产乳酸的鉴定

将分离纯化的可疑菌株以3%的接种量接入装有250mL MRS 液体培养基的500mL 三角瓶中，37℃静置培养48h ，得各菌株的发酵液[6]。

采用纸层析法定性测定乳酸。①展开剂：水:苯甲醇:正丁醇以1:5:5混合后，加1%甲酸。②显色剂：0.04%的溴酚蓝酒精溶液，用0.1mol/L NaOH 调pH 值为6.7。在国产

腌肉中乳酸菌的分离选育

刘晓蓉，邓毛程，连晓蔚

（广东轻工职业技术学院食品系，广东广州510300）

摘要：从自然发酵的腌肉中分离到28株菌株，对其进行形态特征和生理生化特征鉴定，有4株属于乳杆菌属（编号L1、L3、L4、L8）。

发酵性能测试结果表明：L3的产酸能力最强、耐盐性能最好、发酵产品品质优良，为腌肉的优良发酵剂。关键词：腌肉；乳酸菌；分离选育；发酵试验中图分类号：Q93-331文献标识码：A 文章编号：0254－5071（2009）01-0046-03

Isolation and selection of lactic acid bacteria from cured meat

LIU Xiaorong,DENG Maocheng,LIAN Xiaowei

(Department of Food,Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300,China)

Abstract:Twenty-eight microbial strains were isolated from naturally fermented cured meat.On the basis of morphological,physiological and biochemical features,four strains belonged to Lactobacillus ,coded L1,L3,L4and L8.The fermentation characteristics of these four strains were studied.The results showed that L3was a candidate starter for cured meat production because of its high acid production ability,best salt tolerance,and excellent product quality by inoculation fermentation.

Key words:cured meat;Lactic acid bacteria;isolation and selection;fermentation experiment

收稿日期：2008-10-14

基金项目：广东省科技工业攻关项目（2007B080701004）；校级科研项目（2007013）作者简介：刘晓蓉（1973-

），女，湖南娄底人，讲师，研究方向为食品微生物。Research Report

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总第202期

新华1号滤纸上点样，用2%的乳酸标准溶液作为对照，

进行层析。上行约20cm后，取出晾干，喷显色剂，观察样品上行是否出现黄色斑点，比较各斑点的R

f

值[7]。

1.2.6生理生化特征的鉴定

将分离纯化的可疑菌株进行盐还原试验、明胶液

化试验、吲哚试验、H

2

S试验、pH4.5和pH5.4试验以及运动性检查[3-4，8]。根据培养特性查阅细菌分类手册，判定菌属。

1.2.7产酸能力的测试

将各菌株分别按3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃静置培养。每隔2h测定各发酵液的光密度（OD）值（波长680nm）和pH值。

1.2.8耐盐能力的测试

将各菌株以3%的接种量接入到食盐浓度为0%、2%、4%、6%、8%的MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，于波长680nm处测定各发酵液的光密度（OD）值。

1.2.9腌肉发酵初试

猪肉拌上盐和适量的亚盐，接入MRS培养液中培养24h的各菌株，接种量为3%，10℃发酵至pH值为5.0，同时以自然发酵作为对照。测定亚盐含量和进行感官评价。

亚盐含量的测定采用盐酸萘乙二胺法[9]。

2结果与分析

2.1菌落形态观察

乳酸菌分布在MRS平板中部或底层，呈白色或灰白色，圆形或针尖状，扁平或凸起，不透明或半透明，表面光滑、湿润，一般菌落直径＜1mm，周围有溶钙圈。共分离出28株具有上述特征的可疑菌株。

2.2革兰氏染色及过氧化氢酶试验

将分离出的28株可疑菌株进行革兰氏染色和镜检。28株菌中有16株为革兰氏阳性杆菌，其余12株为革兰氏阴性菌。16株疑似菌均为直杆状或短杆状，无芽孢，单个或呈链状排列。

大多数乳酸菌过氧化氢酶反应呈阴性。将上述16株革兰氏阳性菌进行过氧化氢酶试验，其中9株呈阴性，分别编号为L1~L9。

2.3产乳酸的鉴定

将上述9株疑似菌株的发酵液与标准乳酸溶液进行纸层析，以确定乳酸的产生，试验结果见表1。

由表1可得，L1、L3、L4、L8发酵液与标准乳酸具有

相近的R

f

值，表明这4株菌株都能发酵葡萄糖产生乳酸。

2.4生理生化特征的鉴定

对4株菌进行盐还原试验等生理生化特征的鉴定，结果见表2。

由表2可知，4株菌株盐还原试验都是阴性，都不能液化明胶，不能产生H

2

S和吲哚，也不能运动，能在pH4.5的改良MRS培养基中及pH5.4乙酸盐琼脂培养基中生长，因而可确定该4株菌株都属于乳杆菌属。表明乳酸杆菌是腌肉中的优势乳酸菌。

2.5产酸能力的测试

测定4株菌株发酵液的pH值和光密度OD值，结果见图1。

由图1可知，随着培养时间的增加，4菌株的产酸量和OD值都增加，其中L3和L4菌株的产酸速度和OD值较好，在培养的第6h~12h内增加最快，12h左右就能达到很低的酸度和很高的OD值，尤其是L3菌株的产酸能力和繁殖速度最强，接种12h后pH值降低到3.75，OD值增加到0.5；而L8的产酸能力是4菌株中最弱的，培养14h 后pH值仍保持在4.1以上，OD值仅达到0.47。在培养后

表1菌株发酵液的R f值

Table1.R f value of the fermentation broth of nine strains

项目乳酸L1L2L3L4L5L6L7L8L9 R f值0.7430.7380.6570.7450.7400.6320.50.6150.7280.639

注：“+”表示95%以上为阳性；

“-”表示95%以上为阴性。

表2菌株生理生化特征的鉴定结果

Table2.Physiological and biochemical characters of four strains 菌株

盐

还原

明胶

液化

吲哚

试验

H2S

试验

pH4.5

培养

pH5.4乙酸

盐琼脂

运动性L1----++-

L3----++-

L4----++-

L8----++-

图1菌株pH值（A）、OD值（B）的变化

Figure1.Changes of pH（A）and OD（B）for four strains

研究报告47

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2009No．1Serial No．202

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期，pH 值的变化都比较小，这样可避免产品的过度酸化[10]。产酸能力强、繁殖速度快和产酸速率快是乳酸菌活力良好的重要特征，不同菌株间存在较大的差异。在腌肉加工过程中，pH 值快速、大幅度的降低能够显著抑制酵母菌、霉菌以及其他细菌的生长，从而保证腌肉的品质。因此从产酸能力方面分析，L3和L4菌株可选择制作发酵剂。2.6耐盐能力的测试

一般肉制品中食盐浓度为2%~2.5%，而腌腊制品食盐含量超过5%[2]。因此要求乳酸菌具有良好的耐盐性。4菌株在不同NaCl 浓度培养，各发酵液的OD 值变化情况见图2。

由图2可知，食盐浓度的变化对4株菌株的生长都有一定的影响。随着NaCl 浓度的增加，4菌株的生长都呈明显的下降趋势。当NaCl 浓度为2%时，L3菌株的OD 值仍然比较高，为0.657，而L8菌株的OD 值则下降为0.416；NaCl 浓度增加至8%时，L4和L8菌株几乎不能生长，受盐浓度影响较大，而L3和L1菌株的吸光度值＞0.1，表明L3和L1能耐受8%的盐浓度。因此从耐盐能力方面分析，L3和L1菌株可选择制作发酵剂。2.7腌肉发酵初试

猪肉拌盐和辅料后，分别接入培养24h 的4株菌株，10℃发酵至pH 值为5.0，干燥，测定亚盐含量和鉴评感官品质，结果见表3。

由表3可以看出，接种了乳酸杆菌的发酵效果明显优于自然发酵。自然发酵的时间需要30d ，而接种了菌株的发酵时间都在23d 以下，L3菌株只需18d 即可使腌肉的pH 值降为5；对照组亚盐的含量为25.2mg/kg ，人工接种组亚盐含量明显降低，接种L3菌株的腌肉中亚盐含量最低，为1.6mg/kg ；从感官品质方面分析，对照组在色泽、质地、香气方面要逊于人工接种组。说明乳酸杆菌发酵有利于缩短发酵周期、降低亚盐含量、提高产

品品质，4株菌株中以L3菌株的发酵效果最好。

综合2.5和2.6的试验结果，菌株L3产酸能力最强、耐盐性能最好、发酵品质优良，因此选择乳酸杆菌L3菌株作为腌肉的优良发酵菌种。3结论

通过菌落形态观察、革兰氏染色、过氧化氢酶试验，从腌肉中分离到9株乳酸菌疑似菌株，再经产乳酸鉴定、生理

生化特征鉴定，确定4株菌株为乳酸杆菌。最后通过测试其产酸能力、耐盐能力和进行腌肉发酵试验，选育出L3菌株为腌肉的优良发酵剂。研究为开发湖南腌肉这一传统特色风味食品、实现工业化生产提供了一定的理论依据。参考文献：

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表3菌株对腌肉发酵时间、亚盐含量和感官品质的影响Table 3.Effect of four strains on fermenting time ，nitrite content

and sense quality of cured meat

菌株发酵时间/d

亚盐含量/

（mg ·kg -1）感官品质

L120 1.8色红、脂肪乳白、干爽结实、具弹性、

有酱香、味鲜L318 1.6色红、脂肪透明、干爽结实、具弹性、酱香浓、味鲜L421 2.2色红、脂肪乳白、干爽结实、具弹性、有酱香、味鲜L823 3.0色红、脂肪乳白、干爽结实、具弹性、有酱香、味鲜对照

30

25.2

稍暗红、脂肪乳白、干爽、稍软、具弹性、酱香淡、味鲜

图2菌株在不同NaCl 浓度下OD 值的变化

Figure 2.Changes of OD value for four strains at different NaCl

concentration

Research Report

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