Real time PCR操作步骤：从采样到数据处理

1.采样：

1.1采样前的准备：

DEPC水，灭菌手术刀剪，75% 酒精，2 mL无RNA酶离心管，2个盛有DEPC水的烧杯，一个用于冲洗样品，一个用于放置手术刀剪，以减少外界污染。

1.2采样过程中的注意事项：

采样人员需带好口罩和手套，并且尽量少讲话。

当鸡放血致死后，立即解剖，并优先取RNA试验用样品。

取样量约100 mg左右（根据RNA提取方法不同可改变取样量），尽量保证每管取样大小和部位接近一致（可事先取些样品，有个大概的标准即可）。

RNA样品采集于离心管中，立即投入液氮（或者RNA保存液中）冻存，最后统一转入-70 ℃冰箱。根据实验条件选择RNA样品的保存方式，优先选择液氮保存。

建议: 

如果直接投入液氮保存，离心管盖子要盖严，以免液氮渗入管中，导致离心管在转入-70 ℃冰箱时管盖崩开使样品损失。

2.总RNA提取

提取组织和细胞总RNA推荐使用Trizol法。

2.1 Trizol提取总RNA的操作步骤

以下操作需在超净台中进行，超净台使用前需用75% 酒精擦拭台面，紫外灯照射半小时后，打开风机排除臭氧，减少对实验人员的伤害。此外，要提前备用。

1)每50-100 mg样品加1 ml Trizol，使用高通量研磨仪研磨30 s。

2)研磨后样品放置5 min，4 ℃12 000 g离心10 min，上清液转移到另一个1.5 ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。

3)加入200 µL氯仿，用力摇晃15 s，室温放置5 min。

4)4 ℃ 12 000 g离心15 min，上清液转移至另一个1.5 ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。

5)加入500 µL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min，沉淀RNA。

6)4 ℃ 12 000g离心10 min，弃上清。

7)加入1 ml 75% 乙醇（DEPC水配制），用移液器反复吸打乙醇，洗涤RNA沉淀。

8)4 ℃ 7 500 g离心5 min，弃去乙醇。

9)用微型离心机将EP管内壁上的乙醇甩至管底，用10 μL头吸出，打开盖子置于超净台内晾十几秒，但不能让RNA全部干透，内壁上没有水珠即可。

10)根据RNA的量加入无Rnase水60-120 μL，轻弹管壁，充分溶解RNA，混匀后分装出少许用于测定RNA浓度以及用于电泳检测。

11）测定OD260/OD280值以及RNA浓度。取1 μL RNA用DEPC水稀释100倍，紫外分光光度计下读取RNA浓度值和OD260/OD280值（1.9-2.0之间表示RNA纯度较好，小于1.8说明含蛋白质、杂质较多，大于2.2表示RNA降解）。

建议：

建议使用200 μL的头转移上清液，可减少蛋白污染。

可用柱式RNA提取试剂盒，推荐TAKARA公司的产品，提取速度快，无毒性，质量很好，价格比较高。

Trizol推荐invitrogen公司的产品，直接从公司订购要1200元/100 mL，从科昊泽订只要750元/100 mL，所以可以多咨询比对代购的价格。

3.反转录cDNA 

    多用转录试剂盒进行cDNA反转录，按照对应说明书操作即可。反转录过程需在超净台中进行。

    Invitrogen和TAKARA的cDNA反转录试剂盒的质量很高。Invitrogen的试剂盒步骤稍微繁琐，但最后得到的终产物量多。TAKARA的转录速度快，但终产物量少。

    我所用过的产品Invitrogen的货号是C28025-032（50次反应），TAKARA的是PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time，货号DRR036A（200次反应），和之后用的荧光定量试剂盒可以搭配使用。

建议: 

cDNA体系中RNA模板的浓度要一致，可用体系要求模板浓度和所测出的RNA浓度计算所需加模板量和无RNA酶水的量。推荐用excel计算，并打出表格，参照表格进行加样。

4.引物

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR产物的特异性及成功与否。

根据试验选择引物。做Real-time PCR的引物片段最好在200 bp以下。可通过查找相关英文文献来选择引物，文献中会标注目的基因的引物、引物片段长度和在NCBI上的编号。如果引物查找不到，也可自行设计，在NCBI上查找所需基因，得到基因的碱基序列，用DNAMAN设计。

确定了引物序列后，交由公司订购，获得引物后需要验证是否能用。

建议：

实验室所用引物主要在invitrogen公司设计，3天左右能获得引物，也可以在金维智设计引物。国内公司生产速度较快， 1天左右就能完成。

5．Real time PCR

使用TAKARA的SYBR Premis Ex Taq II（Perfect Real Time）试剂盒。试剂盒的实验原理如下：

SYBR® Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBR® Green I 荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

PCR反应生成双链DNA，SYBR® Green I与双链DNA结合后会发出荧光，通过检测荧光信号的强弱，不但可以检测反应体系中的DNA的扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA熔解温度。具体原理见下图：

加样方式推荐先用无菌离心管混好除样品外的所有试剂，颠倒混匀，短暂离心，再分装到每个PCR管中，取第一管时用头吹打数次。分装好后，再向管中加入样本。

按照说明书要求设置程序后，开始进行PCR扩增。

每个样品做2-3个重复，初上手建议做3个重复，数据处理时比较好剔值。扩增结果中Ct值标准差小于0.5时表示技术重复性好。

5． Comparative Delta-delta Ct法

Comparative Delta-delta Ct法即ΔΔCt法，是一种常用的相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。此方法的缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。所以在正式试验开始前，必须对目的基因和看家基因做标准曲线，如果两组标准曲线的斜率之差小于0.1，那么后续实验中就可以用ΔΔCt法进行相对定量分析。反之，如果斜率差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。只能优化反应条件或选择绝对定量方法进行分析。

荧光定量仪器所带的软件可以给出两组标准曲线的R2值、扩增效率、斜率等信息。如下图所示：

对样品进行梯度稀释（1:5），分别对目的基因（HIF-1）和看家基因（actin）做标准曲线。二者斜率分别为-3.159和-3.2，差值小于0.1，所以可以用ΔΔCt法对两种基因进行检测。

进行正式试验，对看家基因和目的基因进行扩增，得到一系列Ct值。导出数据前，可以先在软件中进行数据处理。调整所有结果中同种基因阈值（Threshold）相同。根据熔解曲线（Melt Curve）剔除熔解曲线异常的数据。导出数据后，根据相对定量公式（2-ΔΔCt）计算每个样品基因的相对表达量。

△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组；

实验组和对照组的基因表达差异为2-ΔΔCt。

数据统计方法根据试验设计进行选择。