PET32a_CDK2重组质粒的构建与表达

△通信作者。研究员，博士研究生导师；E－mail：zjh2208@163．com 基础研究

PET32a－CDK2重组质粒的构建与表达*

黄宪章，张战锋，陈炜烨，何敏，庄俊华△

广东省中医院检验科（广州510120）

【摘要】目的构建含有细胞周期依赖性激酶2（CDK2）的PET32a－CDK2重组质粒，利用原核表达体系表达CDK2蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA，采用聚合酶链反应从总RNA中扩增出CDK2基因，并将其插入PET32a质粒，构建重组质粒，化学法转化大肠杆菌DH5α进行克隆。将克隆得到的PET32a－CDK2重组质粒转化入表达菌株BL21，通过异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其蛋白表达，SDS－PAGE和Western－Blot鉴定蛋白表达情况。结果菌落PCR及DNA测序证实CDK2基因已正确克隆到载体中；重组质粒成功转入表达菌株BL21（DE3），SDS－PAGE和Western－Blot结果显示表达菌经IPTG诱导后表达出52kD左右的蛋白。结论

成功构建重组质粒，并且CDK2全长蛋白在原核表达菌BL21中成功表达。

【关键词】CDK2；重组质粒；原核表达

The construction and expression of recombinant plasmid PET32a－CDK2in E．coli．HUANG Xian－zhang，ZHANG Zhan－feng，CHEN Wen－ye，HE Min，ZHUANG Jun－hua．Clinical Laboratory，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou510120，China

Corresponding author：ZHUANG Jun－hua，E－mail：zjh2208@163．com

【Abstract】Objective To construct recombinant plasmid PET32a－CDK2in E．Coli，expressing human CDK2 protein．Methods Total RNA of human white blood cell was extracted for RT－PCR．CDK2gene fragment was ampli-fied by PCR，recombined into recombinant plasmid，and transformed into E．coli DH5αfor cloning．Subsequently，re-combinant plasmid was transformed into the competent cells BL21．The CDK2proteins were induced with isopropy－β－D－thiogalactoside（IPTG）and detected with SDS－PAGE and Western－Blot．Results CDK2gene recombinant plas-mid PET32a was successfully constructed and expressed in E．coli according to DNA sequencing．IPTG－induced pro-karyotic protein of52KD was detected in Western－blot．Conclusion Recombinant plasmid is constructed successfully，with expression of full－length protein of CDK2in E．coli．

【Key words】CDK2；Recombinant plasmid；E．coli

目前已被发现并命名的细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin－dependent kinases，CDKs）有CDK1（cdc2）、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7和CDK8等［1］。其中CDK2由ELLEDGE等［2］在20世纪90年代初鉴定并命名，是细胞周期过程关键调节物质，特别是G

1

/S转换过程，周期蛋白E（Cyclin E）与CDK2结合使细胞进入S期；在S期进程中再与周期蛋白A （Cyclin A）结合进一步加强DNA的合成［3－4］，从而保证细胞周期的顺利完成。CDK2被发现与多种疾病有关，如天疱疮［5］、肿瘤等，其中以对肿瘤的相关性研究为主。MIHARA等［6］认为从口腔黏膜上皮异常增生到鳞癌CDK2的表达有显著改变，并且CDK2的表达与淋巴结转移、肿瘤病理分级、侵袭方式及较短的存活期都有显著相关性。目前，通过抑制CDK2及其相关蛋白的活性阻止肿瘤细胞的增殖以达到控制甚至根治肿瘤的目的成为人们治疗肿瘤的新方向［7］。鉴于目前对CDK2研究的不断深入，本实验建立CDK2蛋白的原核表达体系，从而为对CDK2的下步研究提供实验依据。1材料与方法

1．1材料大肠杆菌DH5α、原核表达载体PET32a 和表达菌BL21（DE3）均由广东省中医院大学城医院检验科陈茶老师惠赠。反转录试剂盒、KOD－Plus高保真聚合酶购自TOYOBO公司，核酸胶回收试剂盒购自OMEGA公司，DNA Ladder、质粒小提试剂盒、性内切酶NOT1、Ecor1以及T4DNA连接酶和Taq聚合酶购自Takara公司，protein ladder购自Fermentas公司，琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂购自OXOID 公司，CDK2单抗和羊抗兔辣根过氧化物酶抗体购自ABCAM公司，其余试剂均为国产或进口分析纯试剂。1．2方法

1．2．1目的基因的扩增根据NCBI检索，确定CDK2的编码区序列，使用Primer5软件设计引物如下：上游引物P1：5'－CCGGAATTCATGGAGAACTTC-CAAAAGGTGGA－3'；下游引物P2：5'－ATAGCGGC-CGCGAGTCGAAGATGGGGTAC－3'。画线部分分别为EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。为方便检测CDK2基因片段，设计另外一对引物如下：上游引物P3：5'－ACTG-GCATTCCTCTTCCC－3'，下游引物P4：5'－TGGCTTG-TAATCAGGCATA－3'。用引物P1和引物P2进行PCR 反应，反应体系为：10ˑBuffer B2.0μL，引物P1（10μmol/L）和引物P2（10μmol/L）各0.6μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2.0μL，KOD－PLUS酶0.5μL，MgCl

2

（25 mmol/L）0.8μL，cDNA1μL，加去离子水补充总体积至20μL。

PCR扩增仪上进行反应：先于94ħ条件下进行变性4min，然后按94ħ30s，58ħ30s，68ħ1min共30个循环后，68ħ延伸7min，置于4ħ保存。PCR产物通过0.7%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1．2．2重组质粒的构建PCR产物纯化后与PET32a 质粒同时进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化进行连接反应，按10μL 反应体系：10ˑ连接缓冲液，1μL；PET32a载体1μL，PCR产物4μL，T4DNA连接酶1μL，去离子水补充至10μL。混匀后瞬时离心，置22ħ过夜连接。连接产物化学法转化入大肠杆菌DH5α，使用含终浓度为50 mg/L氨苄青霉素的LB平板进行筛选，对平板上生长单菌落进行PCR鉴定，反应体系：10ˑBuffer1μL，引物P3（10μmol/L）1μL，引物P4（10μmol/L）1μL，Taq酶0.1μL，加去离子水补充总体积至20μL。反应条件：94ħ4min；94ħ30s，55ħ30s，72ħ30s，进行30个循环；72ħ延伸5min，4ħ保存。PCR产物通过0.7%琼脂糖凝胶电泳进行检测，挑选PCR阳性克隆送广州英伟捷基公司测序。

1．2．3重组质粒PET32a－CDK2转化BL21（DE3）及阳性克隆的筛选对测序阳性菌进行培养提取重组质粒，将重组质粒化学法转化表达菌株BL21（DE3），用含氨苄青霉素的LB平板进行筛选，对平板上生长单菌落用P3、P4引物进行PCR鉴定，PCR阳性克隆送广州英伟捷基公司测序。

1．2．4重组蛋白的优化诱导表达及鉴定挑取筛选出的阳性BL21（DE3）但克隆菌株于新鲜含氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养。各取500μL过夜培养菌液于3个均含10mL无抗生素新鲜LB培养基的烧瓶中，置于摇床内以37ħ、240r/min剧烈摇动2h后加入IPTG至IPTG终浓度分别为0.5、1、2mmol/L并继续以37ħ、240r/min摇动培养。在加入IPTG的0、1、2、3、4h各取1mL菌液进行SDS－PAGE和Western－Blot鉴定。

2结果

2．1PCR扩增结果扩增产物经琼脂电泳鉴定，在750 1000bp之间可见一清晰条带，目的片段为7bp（图1）

。

1：DNA Ladder DL2000；2：CDK2编码基因扩增产物

图1PCR扩增CDK2编码基因序列

2．2PET32a－CDK2重组质粒转化DH5α后菌落PCR 鉴定对平板上生长的单菌落用引物P3、P4进行PCR，在250 500bp之间有特异片段，目的片段为423 bp（图2）。DH5α菌株测序结果与目的基因系列一致

。

1：DNA Ladder DL2000；2：CDK2目的片段的阳性对照；3：含PET32a空质粒的阴性对照；4 8：挑取平板上不同单菌落PCR结果图2PET32a－CDK2重组质粒的PCR鉴定

2．3含重组质粒PET32a－CDK2的BL21（DE3）转化菌株的筛选重组质粒转化BL21（DE3）后对平板上生长单菌落用引物P3、P4进行PCR鉴定，在250 500 bp之间有特异片段，目的片段为423bp（图3）。PCR 阳性BL21（DE3）菌株测序结果：BL21（DE3）菌株测序结果与目的基因系列一致

。

1：DNA Ladder DL2000；2 5：平板上不同单菌落PCR结果；6：阳性对照；7：含PET32a空质粒的阴性对照

图3重组质粒PET32a－CDK2转化入BL21（DE3）菌株挑取单克隆菌落PCR检测结果电泳图

2．4IPTG诱导表达BL21（DE3）菌株产物的SDS－PAGE检测挑选PCR阳性BL21（DE3）菌株进行3个浓度IPTG诱导表达，对不同诱导浓度和不同诱导时间收集的菌液进行SDS－PAGE检测，在40 55kD之间有随着诱导时间的延长逐渐增强的条带，目的蛋白为52kD（CDK2全长蛋白为34kD，与CDK2蛋白融合的PET32a质粒标签蛋白为18kD），（图4）。

M ：protein Ladder ；1 5：0.5mmol /L 浓度IPTG 诱导0、1、2、3、4h 后菌液SDS －PAGE ；6 10：1mmol /L 浓度IPTG 诱导0、1、2、3、4h 后菌液SDS －PAGE ；11 15：2mmol /L 浓度IPTG 诱导0、1、2、3、4h 后菌液SDS －PAGE 图4

含重组质粒BL21经不同浓度IPTG 诱导0 4h 后对其表达蛋白的SDS －PAGE 鉴定

2．5

IPTG 诱导表达BL21（DE3）菌株产物的Western －Blot 检测挑选PCR 阳性BL21菌株进行3个浓度

IPTG 诱导表达，对不同诱导浓度和不同诱导时间收集的菌液进行Western －Blot 检测，

在40 55kD 之间有随着诱导时间的延长逐渐增强的荧光条带，目的蛋白为52kD （图5）。3

讨论

在蛋白研究方面，现国内多用细菌表达体系获得所需蛋白。当利用基因工程方法表达蛋白质时，除了考虑外源蛋白表达后的性质，还要考虑目的蛋白是否胞外蛋白、表达量，以及有无简单易行的纯化方法对表

达的蛋白质进行纯化，以获得高纯度蛋白质。外源蛋白质的高效表达与表达系统及表达条件密切相关。大肠杆菌表达系统是较为常用的一种。其优点是

遗传背景比较清楚，

表达水平较稳定，易操作，有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供选择，

并且成本

1 5：0.5mmol /L 浓度IPTG 诱导0、1、2、3、4h 菌液Western －Blot ；6 10：1.0mmol /L 浓度IPTG 诱导0、1、2、3、4h 菌液Western －Blot ；11 15：2.0mmol /L 浓度IPTG 诱导0、1、2、3、4h 菌液Western －Blot

图5

含重组质粒BL21经不同浓度IPTG 诱导0 4h 后对其表达蛋白的Western －Blot 鉴定

低、蛋白表达量高、容易纯化等。本实验从人外周血单核细胞中提取总RNA ，通过PCR 得到了人CDK2基因，

并将其插入原核表达质粒PET32a （+），构建了重组表达载体PET32a －CDK2。在重组质粒的构建过程中，

本实验是通过化学法将CDK2和质粒连接反应液转化DH5α感受态，感受态是本实验室通过CaCl 2法制备获得，由于多种原因导致转化效率较低，将转化后菌液涂布到含抗生素平板上过夜培养后平板上只生长5个单菌落，挑取各个单菌落进行PCR 检测后发现只有1个单菌落为PCR 阳性，可能是由于质粒酶切不完全使连接产物中含有空质粒从而导致转化中产生阴性单菌落。将PCR 阳性单菌落挑至新鲜的LB 液体培养基中过夜培养，第2天将菌液送广州英伟捷基公司测序，测序中所用到的引物为自备的P1、

P2引物。测序结果在NCBI 网站进行比对，比对结果显示测到的序列和CDK2编码序列完全相符。挑取阳性菌落至5mL 新鲜LB 液体培养基过夜培养，第2天提取质粒。由于不能确定回收后质粒浓度，所以在进行表达菌株转化的时候分别取回收后质粒2、

5、8μL 进行转化。转化液涂布平板过夜培养发现加2μL 质粒进行转化所涂布平板长4个单菌落，

5μL 质粒进行转化所涂布平板长1个单菌落，

8μL 质粒进行转化所涂布平板无菌落生长。其中导致转化效率低的原因可能有两点：一是质

粒浓度较高；二是感受态效率较低。不过对5个单菌

落经PCR 后发现均为阳性，将5个单菌落于新鲜LB 中培养后均送测序，结果经比对后发现均和CDK2编码序列完全相符。挑取其中任意一个菌落进行IPTG 诱导，成功地在大肠杆菌中表达出了人CDK2蛋白，该重组蛋白主要以包涵体形式存在。对工程菌表达条件进行了初步的优化，结果显示，

IPTG 浓度（0.5 2.0mmol /L ）对CDK2蛋白表达量的改变无明显影响，而随着诱导时间的延长蛋白表达量有上升趋势，

在0 4h 内第4个小时表达量最高。在进行诱导后对表达蛋白进行检测时是直接对混匀菌液进行裂解、变性，并不是对菌液进行离心取菌体沉淀检测，通过SDS －PAGE 结果可以看出目的蛋白的含量明显高于杂蛋白，说明CDK2在此体系中具有良好的表达效果。

该研究结果为进一步获得人CDK2重组蛋白，并研究其结构、功能活性和抗备等奠定了一定的实验基础。

参考文献

［1］MORGAN D O．Cyclin dependent kinases ：engines ，clocks ，and mi-croprocessors ［J ］．Annu Rev Cell Dev Biol ，1997，13：261－291．［2］ELLEDGE S J ，SPOTTSWOOD M R．A new human p34protein

kinase ，CDK2，identified by complementation of a cdc28mutation in Saccharomyces cerevisiae ，is a homolog of Xenopus Eg1［J ］．EMBO J ，1991，10（9）：2653－2659．

［3］MORGAN D O．Principle of CDK regulation ［J ］．Nature ，1995，374（6518）：131－134．

［4］TSAI L H ，HARLOW E ，MEYERSON M．Isolation of the human

cdk2gene that encodes the cyclin A －and adenovirus E1A －asso-ciated p33kinase ［J ］．Nature ，1991，353（6340）：174－177．［5］LANZA A ，CIRILLO N ，ROSSIELLO R ，et al．Evidence of key

role of Cdk2overexpression in pemphigus vulgaris ［J ］．J Biol Chem ，2008，283（13）：8736－8745．

［6］MIHARA M ，SHINTANI S ，NAKAHARA Y ，et al．Overexpres-sion of CDK2is a prognostic indicator of oral cancer progression ［J ］．Jpn J Cancer Res ，2001，92（3）：352－360．

［7］SQUIRES M S ，FELTELL R E ，WALLIS N G ，et al．Biological

characterization of AT7519，a small －molecule inhibitor of cyclin －dependent kinases ，in human tumor cell lines ［J ］．Mol Cancer Ther ，2009，8（2）：324－332．

（收稿日期：2010－11－25

编辑：蔡欣櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆

）

胫骨促结缔组织增生性纤维瘤1例

冯盼盼▲，全显跃

南方医科大学珠江医院影像诊断中心（广州510282）患者，女，25岁，因右小腿上部活动后疼痛4个月，加重10d 于2010年3月24日住院。体格检查：跛行步态，右下肢明显畸形，右大腿股四头肌明显萎缩，右小腿上端靠近右膝关节肿胀，局部皮温高，压痛，屈曲伸直活动时疼痛明显。影像学表现：右膝关节正侧位X 线平片示右胫骨上端范围约6.5cm ˑ4.1cm 的骨质密度减低区，边缘欠清，其下缘见轻度骨质硬化边，上缘达胫骨膝关节面，病变区密度不均，可见斑片状更低密度区，局部骨膨胀不明显，局部骨膜增生亦不明显（图1A ）。

膝关节MR 检查示右胫骨上端（累及干骺端）混杂信号骨质破坏区，主要呈长T1、长T2信号，信号不均，范围约49mm ˑ44mm ˑ65mm ，有不完整骨硬化边，其内可见长T1、短T2信号分隔及多发不规则更长T2信号坏死区，后方骨皮质破坏，并形成软组织肿物，矢状位测量肿物大小约33mm ˑ14mm ，病变达胫骨关节面下，增强扫描骨质破坏区可见明显不均匀强化（图1B 、C 、D ）。病理学表现：大体标本示灰白色碎组织一堆，大小为7.0cm ˑ4.0cm ˑ2.5

cm ，切面灰白色，质中；灰白色不整形组织一块，大小为3cm ˑ2cm ˑ1cm ，切面灰白色，质韧，似有包膜。镜下所见：瘤组织由增生的梭形细胞构成，胶原成分较多，其间可见灶性新生骨－软骨形成，部分区域黏液变，瘤细胞异型性不明显，核像罕见，未见坏死。免疫组化：Vimentin （波形蛋白）阳性，S －100蛋白阴性，Ki －67（肿瘤细胞增殖指标）＜1%阳性。病理学诊断：（右胫骨）促结缔组织增生性纤维瘤（注：此瘤可以浸润性生长，甚至突破到骨外）

。

A ：X 线平片示：右胫骨上大片骨质密度减低区，其下缘见轻度骨质硬化边；

B D ：MR 平扫及增强示：右胫骨上端（累及干骺端）偏后侧混杂骨质破坏区，主要呈长T1，长T2信号，并形成软组织肿物，骨膜增生不明显，未见明确肿瘤骨，增强扫描可见明显不均匀强化

图1

胫骨促结缔组织增生性纤维瘤影像学表现

讨论骨促结缔组织增生性纤维瘤非常罕见，约占原发性骨肿瘤的0.1%，30岁以下好发，青少年多见。WHO （2002）骨肿瘤新分类中定义其为“一种罕见的良性骨肿瘤，由轻度异型的梭形细胞及其产生的大量胶原构

成”。复习国内、外文献，有见报道发生于颅骨、颌骨及股骨等，发生于胫骨的促结缔组织增生性纤维瘤国外有报道，国内尚未见报道。

影像学特征：X 线平片上表现为胫

▲南方医科大学在读硕士研究生

骨上端的溶骨性骨质破坏，膨胀不明显，局部骨膜增生不明显，可见轻度的骨质硬化，仔细辨别，有时可看到周围的软组织包块影。MR 检查表现为胫骨上端长T1长T2为主的骨质破坏区，周围骨质硬化边较平片明显，其内可见多处间隔（增强扫描时更明显），并周围软组织肿块形成，软组织与骨质破坏区可见线样的骨皮质，骨皮质可见局部的不连续，以骨质破坏区及软组织境界均较清晰、软组织内无肿瘤骨及骨膜增生不明显为特点。

发生于的胫骨的其他肿瘤的鉴别

诊断：（1）骨肉瘤：青少年多见，以膝关

节疼痛、肿胀为主要症状，

X 线表现为溶骨性破坏，可见软组织内肿瘤骨及骨膜增生形成的Codman 三角征；（2）软骨肉瘤：好发于30岁以上成年人，发病缓慢，开始为隐痛，以后逐渐加重，可产生压迫症状；（3）骨巨细胞瘤：好发于20 40岁，女性多于男性，局部包块压

之有乒乓球样感觉和压痛，

X 线表现为骨端偏心位溶骨性破坏而无骨膜反应，病灶骨皮质膨胀变薄，呈肥皂泡样改变。

（收稿日期：2010－12－07

编辑：蔡欣）