qRT-PCR流程

摘要：苯酚的主要作⽤是裂解细胞，使细胞中的蛋⽩，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋⽩质，但不能完全抑制RNA酶活性。

　　qRT-PCR，是Quantitative Real-time PCR 的简称，也叫实时荧光定量PCR，是⼀种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物的总量，通过内参或者外参法对待测样品中特定DNA序列进⾏定量分析的⽅法。

　　qRT-PCR⽬前已成为不同样本间进⾏基因表达⽔平差异⽐较权威的⽅法。然⽽不适当的实验设计，没有⾜够的对照和重复，低质量的RNA样本，逆转录引物选择不理想，qRT-PCR的引物退⽕温度选择不当和数据分析⽅法不正确等都可能会成为影响qRT-PCR检测灵敏度的因素。　　下⾯普健⽣物就从8个⽅⾯带你详细了解⼀下qRT-PCR的注意事项，以提⾼你的实验成功率。

　　1、实验设计

　　由于RNA易降解,对外在环境敏感，因此在实验条件或样本操作等各个环节都需要严格把控。

　　2、RNA抽提

　　RNA的抽提环境⾮常关键。由于RNA酶⽆处不在和其难以灭活的顽固本性，在实验的每⼀步，任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成RNA酶的污染，从⽽导致整个实验的失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。

　　RNA抽提建议⽤专⽤的操作区，离⼼机、移液、试剂等均应专⽤；所⽤的耗材、溶液及试剂均应是RNase-free或经过DEPC处理过的（这⼀步很费精⼒但不得不做，所以失败了会很痛苦）；操作过程中应始终戴⼀次性橡胶⼿套，并经常更换，以防⼿臂上的细菌、真菌以及⼈体⾃⾝分泌的RNA酶造成污染；避免在操作中说话聊天并且要记得戴⼝罩以防RNA酶污染；提取过程应尽量保持低温环境（所以戴个⼿套是正确的选择）并减少操作时间。

　　关于什么是Trizol，某百科是这样说的：　

　　Trizol是⼀种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。苯酚的主要作⽤是裂解细胞，使细胞中的蛋⽩，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋⽩质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加⼊了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基⼄醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。为缩短RNA抽提的操作时间，建议以10-20个样本的⼩批次来处理样本。⽆论是Trizol ⼿提RNA还是使⽤试剂盒抽提RNA都应包括DNaseI处理步骤以便去除基因组DNA污染。如果样本在采集后不能⽴即处理，则需要把样本保存于-80℃（样本直接冻存或保存于Trizol中）。

　　3、RNA 质量控制

　　在qRT-PCR中使⽤⾼纯度（⽆污染）和⾼完整性（⽆降解）的RNA是最基本的要求。不纯的RNA样品会抑制PCR反应，产⽣偏离的数据。使⽤部分降解的RNA会产⽣可变和不正确的定量结果。因此RNA样品的纯度和完整性是进⾏下游实验的最基本要求。

如何检测？

RNA样品是否有蛋⽩污染可以通过OD260/280分光光度法来进⾏检测。⽐值在1.8-2.2之间则表

⽰该RNA质量好，没有蛋⽩和苯酚的污染。

RNA的完整性可通过甲醛变性琼脂糖电泳（普通的琼脂糖凝胶电泳也可）来观察。

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⾼完整性的RNA样品可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S的条带亮度约是18S的两倍。

若两条条带不明显，则提⽰RNA可能部分降解。

　　通过确保所有RNA样品的纯度和质量的⼀致性可以降低⽣物学重复的差异。

　　4、逆转录

　　鉴于RNase在环境中⼴泛存在，我们建议在检验RNA的质量后将总RNA样本⽴即逆转录为cDNA。这种处理避免了RNA样品因反复冻融或其他不当操作⽽导致RNA降解。

　　在逆转录步骤中，最关键的是抽提的RNA样品能否完整地覆盖基因组。使⽤mRNA末端配对引物（Oligo dT primer）和mRNA序列随机位点配对引物（Random primer）的组合可以得到每个基因的逆转录产物群。此⽅法⽐单⼀的末端或随机位点配对引物进⾏逆转录得到的cDNA可以更好地覆盖基因组。为了减少不同⽣物学重复之间的差异，每次逆转录使⽤的RNA量和反应时间应相同。逆转录后的cDNA可长期冻存于-20℃或-80℃。

　　5、引物和扩增⽚段的设计

　　引物的设计和⽬标序列的选择对有效地扩增和产物的特异性⾄关重要。⽬标序列应是唯⼀的，长度建议在75-300 bp之间，GC含量约50%-60%。⽬前有许多引物设计软件及在线设计⽹站，操作者应在设计和实验阶段保证扩增⽚段的特异性。建议引物的GC含量在50-60%之间，退⽕温度在55℃-65℃。

AtaGenix出品的典型扩增曲线是这样的

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　　6、qRT-PCR的扩增与验证

　　PCR反应中引物与⽬的序列的退⽕温度选择⾮常关键。在合适的温度下，引物可有效地与其⽬标序列进⾏退⽕，并降低了⾮特异性退⽕和引物⼆聚体的形成。在正式进⾏qRT-PCR之前应该对退⽕温度进⾏优化（可以通过做梯度PCR来优化）。PCR产物的特异性对于结果也⾄关重要。通过PCR反应后进⾏的溶解曲线的分析，可对产物的特异性进⾏检测：溶解曲线应该显⽰出⼀个单⼀尖锐的峰。

AtaGenix出品的典型的溶解曲线是这样的

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　　此外，应⽤琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的⼤⼩是否正确。

　　7、数据分析

　　在qRT-PCR实验中，内参基因被⽤来作为数据标准化的对照，以校正作为模板的cDNA所存在的数量差异。常⽤来作为内参的有GAPDH、β-actin或rRNA。操作者应根据不同来源的样品选择不同的参照基因。

　　进⾏相对基因表达分析普遍采⽤操作简便的2-ΔΔCT法，此⽅法的应⽤基础是⽬标基因和参照基因的扩增效率都接近100%并且相互间效率偏差在5%以内。所有实验组（Test）和对照组（Control）均应得到内参基因的CT值(CTreference)和⽬的基因的CT值(CTtarget)，⽤各组的内参基因CT值归⼀⽬标基因的CT值：

ΔCT（test）=CT（target,test）- CT（reference,test）

ΔCT（control）=CT（target, control）- CT（reference, control）

接下来，⽤对照组的ΔCT值归⼀实验组的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test）-ΔCT（control）

最后，计算表达⽔平⽐率：

实验组⽬的基因相对对照组⽬的基因的表达量=2-ΔΔCT

得到的结果是通过参照基因表达⽔平校准的实验组中⽬的基因相对于对照组中⽬的基因增加或减少的倍数。

　　8、实验的重复性和重现性

　　在qRT-PCR的检测中，有两个可变因素可能会影响实验结果：⼀个是不同⽣物个体，组织或细胞等样本间基因表达⽔平的内在差异所导致的⽣物学差异；另⼀个是移液操作或移液器本⾝等原因导致的实验过程本⾝存在的技术差异。为减少⽣物学和技术差异的影响，⼀般认为在实验中⾄少要设置三个⽣物学样品重复且每个⽣物学样品⾄少应有三个技术性重复。

参考⽂献：⽂章参照并引⽤了部分实验荧光定量PCR的国际化标准MIQE指南及BIO-RAD荧光定量PCR应⽤指南。