产蛋白酶菌株的分离

一、教学目标及基本要求

1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术

   2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法

   3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术

   4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法

二、实验原理

枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。

1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。

由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。

2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。

利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。

3. 枯草芽胞杆菌的形态特征

枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。

4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性

    枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。

三、实验材料

1. 样品：  从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样，

并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取）

2. 培养基 

① 肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。

组成： 牛肉膏0.5%   蛋白胨1%  NaCl 0.5%  pH 7.2～7.4  121℃，灭菌20min

② 酪素培养基（附录Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12个平板，每组6个平板）

组分 配方要求(%) 母液浓度(%) 各成分的取量（mL）/200ml

KH2PO4 0.036 3.6 2

MgSO4•7H2O 0.05 5 2

ZnCl2 0.0014 0.14 2

Na2HPO4•7H2O 0.107 10.7 2

NaCl 0.016 1.6 2

CaCl2 0.0002 0.02 2

FeSO4 0.0002 0.02 2

*酪素 0.4 4 20

Trypticase 0.005 0.5 2

琼脂 2.0  

* 酪素的母液浓度为4%，是将4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃热水稀释到所需浓度（即定容到100 mL），即得到母液浓度围4%的酪素溶液。

各组分的母液由老师配制好，学生按照200ml的体积直接取样加入即可。

pH 6.5～7.0，121℃，灭菌20min，倒好平板后进行无菌检查。

③ 生理盐水：0.85% NaCl水溶液，9 mL/支×10支

④ 其他：平皿10套、温度计、水浴锅、移液管、显微镜、涂布器2个，三角瓶（250mL， 500 mL规格）、革兰氏染色液等。    

四、实验内容

1.采样

学生从地表下10～15cm的土壤中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等等。

2. 增殖培养（富集培养）

一般来讲，样品所占欲分离微生物的数量较少，利用微生物所需营养的区别，在增殖培养基中使某些微生物的生长受到抑制，而对某些微生物可促进它们的生长，从而达到分离所需微生物的目地，这种培养称为增殖培养。

取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和各取一点土，混匀，称取1g，置于装有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，六层纱布封口，于80℃水浴加热处理10min，以杀死样品中的微生物营养体细胞。然后30℃，150 r/min，振荡培养24h。取样镜检形成芽孢的情况。

3. 涂布分离

将增殖培养液置于80℃水浴中加热10min，再次杀死不形成芽孢的营养体细胞，以浓缩芽孢杆菌（第二次加热处理前，取1ml培养液经适当稀释后作革兰氏染色，观察是否有枯草芽孢杆菌存在，本实验中略去该步骤）。

然后取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释到10-4，10-5，10-6等。分别取0.1mL菌液于无菌的酪素培养基平板上（初筛平板，每个稀释度平均两皿），用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在酪素平板上，倒置于30℃培养箱中培养24~48h。观察酪素平板上菌落周围的透明圈，挑(H/C)比值大的菌接入斜面培养基，30℃培养24h，备用。

4. 纯化

   用平板划线分离法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分离纯化挑选出的菌株。

5. 纯种鉴定

   菌种经革兰氏染色，油镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。

  ① 细胞形态，菌落特征，芽孢形成情况。

  ② 产蛋白酶能力的测定：直接观察在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈。

6.菌种保藏   该实验分离得到的枯草芽孢杆菌作为后续实验的菌种使用。

五、结果与讨论

绘制菌体形态图，计算不同单菌落的H/C。

六、实验任务

获得的H/C比值大、产蛋白酶活力高的枯草芽孢杆菌菌株。

七、教学重点及难点

1．掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法

2．掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法

八、教学方法和手段

详细讲解和板书，并结合实物进行讲解和示范，强调操作注意事项。