细胞冻存和复苏

     细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。

冻存和复苏的原则

冻存细胞的理论基础

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。        

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

细 胞 冻 存 方 法

预先配制冻存液： 20%血清培养基

                   10%DMSO （二甲基亚砜）

取对数生长期细胞1ml于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106—5×106细胞/ml)，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

慢 冻 程 序

标准程序（放哪里？）

当温度在-25 ℃以上时，1-2 ℃/min

当温度达-25 ℃以下时，5-10℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中

简易程序

      将冻存管于4℃放置1小时，于-20℃放置1小时，通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70℃），放置1小时，后直接投入液氮中（-196℃）

细 胞 复 苏 方 法

从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）

  注意防护（冻存管爆炸）！

5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上

低速离心10分钟

去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞

低温保护剂的应用

在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。

常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

注意事项：

在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。 

在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。 

应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。 

冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-196 ℃的液氮中取出冻存管，立即投入37℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。 

污染的类型

        细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质和细胞（非同一种的其他细胞）。

微生物污染的途径

空气：微生物传播的最主要途径。

器材：清洗消毒不彻底。

操作：无菌观念不强，操作不规范。

血清：支原体或病毒污染。

组织样本：造成原代培养污染。

微生物污染对细胞的影响

体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力；

培养基中加入的抗生素的抗污染能力有限；

培养细胞一旦发生污染，多数将无法挽救；

污染早期或污染程度较轻时，及时处理，部分细胞有可能恢复。

污染物持续存在对细胞的影响：

轻者细胞生长缓慢，相对减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞质中出现较多的颗粒状物质；

重者细胞增殖停止，相消失，胞质中出现大量的堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。

微生物污染的检测

    真菌污染

      真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孢子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌等。

    培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

    细菌污染

      细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。

    培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。

    支原体污染

      支原体是介于细菌与病毒之间能生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除干净，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.6－8.0)下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。

     培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。

     病毒污染

     采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞和会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

    非同种细胞污染

      由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

   化学成分的污染

      非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

污染的鉴别

     1、细菌、真菌污染的检测

    （1）肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。

  （2）镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

  （3）接种观察 采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。

      支原体污染的检测

     （1）相差显微镜观察

     将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片)，24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放置于载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别

   （2）低渗溶涨处理地衣红染色观察 

      固定染色法，通过对细胞低渗处理，使细胞体积扩张，细胞膜表面的褶皱和结构减少，使附在细胞表面的支原体容易被识别。

      取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液，用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞。用新配制的Carnoy液固定两次，每次10分钟，取出盖片凉干。用培养液时，先吸取1mL，500～800r/min离心5分钟后去除上清，留0.2mL，将0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分钟，加入Carnoy液固定，离心弃上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成2～3张涂片。然后用2%醋酸地衣红(地衣红2g，冰醋酸60mL，加蒸馏水至100mL)染5分钟。纯酒精过三次，每次1分钟，封入Euparal或树胶中。若染色过深，可先用75%酒精脱色，再封片。镜下观察见支原体呈暗紫色小点，位于细胞外或细胞之间。

   （3）荧光染色法观察 

       用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为：用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸钾固定10分钟，再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理盐水配制)中染色10分钟，置于蒸馏水漂洗1～2分钟，向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液，先离心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟，再用生理盐水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水，加3～5滴pH5.5磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈亮绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。

    （4）电镜检测 若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法。

（5）培养检测 将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基（Sigma或北京生物制品所生产的均可），培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。 

污染的清除和预防

污染的清除

      培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。

      1、使用抗生素

     抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL)，污染后清除用药需采用大于常用量5－10倍的冲击处理，于加药后作用24－48小时，再换常规培养液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400－800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理，每隔2－3日换液1次，传1－2代进行治疗。

    2、加温处理

      将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后，再以41℃加温处理效果更佳。

    3、使用支原体特异性血清

    用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。

    4、其他方法

     除了上述去除污染的方法外，还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等，但均较麻烦，且效果不确定。所以一旦支原体污染，除非有特别重要价值，一般均弃之重新培养。

污染的预防

        预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：

    1、从物品、用品消毒灭菌着手

      细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。

      2、从操作者做起

 （1）操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。

 （2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

 （3）操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。

    3、防止细胞交叉污染

在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。

在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。

基础篇-细胞冷冻保存 （一）

  1. 注意事项： 

  1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。 

  1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 

  1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micronFGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

  1.4. 冷冻保存之细胞浓度： 

1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 

1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。 

1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 

1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。

    1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 

    1.6. 冷冻方法： 

1.6.1. 传统方法: 4℃ 10 分钟---> -20℃ 30 分钟---> -80℃ 16 - 18 小时(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 长期储存。 

1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以–1 - -3℃/分钟之速度由室温降至–120℃，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 

基础篇-细胞冷冻保存 （二）

  2. 材料： 

2.1. 生长良好之培养细胞 

2.2. 新鲜培养基 

2.3. DMSO (Sigma D-2650) 

2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 

2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 

2.6. 血球计数盘与盖玻片 

2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II) 

 3. 步骤： 

3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 

3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。 

3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 

  3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 

3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16-18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。 

3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL 

基础篇-冷冻细胞活化 

1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 

2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。 

3. 材料 

 37℃ 恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶，液氮或干冰容器。 

  4. 步骤： 

4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 

4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 

4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 

4.4 取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 

4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。 

4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。 

4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

基础篇-收到细胞的处理方式 (一)

1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。 

2. 冷冻细胞解冻程序: 

2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类，若因实验需要，必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，方进行所需之实验。 

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。 

  2.3. 将培养基置于37°C 水槽中回温，回温后喷以70% 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入37°C 水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。 

2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基，混合均匀，放入37°C，5 % CO2 培养箱培养。 

2.5. 对绝大多数细胞而言，1% 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，离心300 xg (约1000 rpm)，5分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，转移至培养瓶中，再放入37°C，5% CO2 培养箱培养。

基础篇-收到细胞的处理方式 (二)

  收到T25 flask 细胞时，处理方式为︰ 

1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。 

2. 将原封之T25 flask 静置于37°C， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37°C，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。