实时荧光定量PCR详细操作步骤

来源：动视网责编：小OO 时间：2025-10-02 00:59:20

实时荧光定量PCR详细操作步骤

实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA500ng，100mg肺提取RNA200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反应反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。反转录反应条件如下。37°C15min（反转录反应）85°C5sec（反转录酶的失活反应）RealTimePCR反应选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18SrRNA(18SrRNA)做为内参。基因引

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导读实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA500ng，100mg肺提取RNA200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反应反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。反转录反应条件如下。37°C15min（反转录反应）85°C5sec（反转录酶的失活反应）RealTimePCR反应选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18SrRNA(18SrRNA)做为内参。基因引

实时荧光定量PCR

组织RNA提取：

一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。

反转录反应

反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。

反转录反应条件如下。

37°C 15 min（反转录反应）

85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）

Real Time PCR反应

选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。

基因		引物序列	扩增片段长度
NR2B	NR2B(+)	CCGCAGCACTATTGAGAACA	213 bp
NR2B	NR2B(–)	ATCCATGTGTAGCCGTAGCC	213 bp
18s rRNA	18s rRNA(+)	tttgttggttttcggaactga	198 bp
18s rRNA	18s rRNA(–)	cgtttatggtcggaactacga	198 bp

1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂	使用量	终浓度
SYBR® Premix Ex TaqTM（2×）	μl	1×
PCR Forward Primer（10 μM）	1 μl	μM
PCR Reverse Primer（10 μM）	1 μl	μM
模板（cDNA溶液）	μl
dH2O	10 μl
Total	25 μl

全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为 μl。

2）三步法PCR

首先95°C 作用3 min。

PCR进行35个循环。

步骤	温度	时间
变性	95°C	30 秒
退火	58°C	30 秒
延伸	72°C	30 秒

融解曲线

温度	时间	变温速度
95°C	0秒	20°C/秒
55°C	15秒	20°C/秒
95°C	0秒	0.1°C/秒

实时荧光定量PCR详细操作步骤

实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA500ng，100mg肺提取RNA200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反应反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。反转录反应条件如下。37°C15min（反转录反应）85°C5sec（反转录酶的失活反应）RealTimePCR反应选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18SrRNA(18SrRNA)做为内参。基因引

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