副溶血弧菌检验标准方法免疫荧光法

连云港市产品质量监督检验所 发布

2010-08-01  实施

2010- 08 -01发布

食品中副溶血性弧菌

免疫荧光镜检快速筛查法

DB32/T              -2010

发

江苏省地方标准

B66

`

1前    言

本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的免疫荧光镜检快速筛查法。

  本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。

本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。

本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。

    本标准主要起草人： 周翔    

    本标准于2010年8月首次发布。

食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法

11　范围

本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫荧光快速筛查检验方法。

本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。

本标准检出限为 10 CFU/g

12　规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 20001.4-2001  标准编写规定 

实验原理       

荧光抗体染色是荧光显微镜标本上的抗原—抗体反应和荧光结合第二抗体反应。必须制成镜检标本。作为检测抗原目的标本片，细菌检样作成单层。夹心法，即用未标记的特异性抗原加在玻片上先与菌体中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而在荧光激发下间接地显示出菌体中抗体的存在。

3　设备

3.1  拍打式均质器。

3.2  电动试管振荡器。

3.3  低温高速冷冻离心机（25000r/min）

3.4  全自动加液器（10~1000μl）　

 3.5  天平（0.1g）

3.6  直落式荧光显微镜

3.7  水套式培养箱

3.8  冰箱（0~8℃）

3.9  湿盒

3.10 20ml一次性注射器

3.11 无荧光盖玻片

3.12 无荧光载玻片

3.13 洗片缸

3.14 标本缸（存放实验片待灭菌）

3.15 高压灭菌器

4　试剂

4.1  副溶血型弧菌羊抗血清

4.2  兔抗羊荧光抗血清

4.3  甲醇 

4.4  无荧光丙三醇（甘油）

4.5　 PBS缓冲液 

4.6　无菌高纯蒸馏水（无荧光）

4.7　次氯酸钠消毒液

4.8  封片甘油：无荧光甘油9份，pH7.2 PBS 1份

5　样品制备 

5.1　 冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18 h解冻。若不能及时检 验, 应放于5℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于6～10℃冰箱保存,在24 h内检验。

5.2　 取样:以无菌操作进行。 

5.2.1 鱼类:取鱼体不同部位。

5.2.2贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类,则应先在清洁的流水中洗刷净外壳,然后以无菌操作打开贝壳,取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。

5.2.4甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。

5.2.5将样品称取25克，于100ml0.45%生理盐水—TWEEN80中均质拍打20分钟，1500r/min,10min,离心，吸取上清液到第二个离心管中。加入5ml有机试剂，2000r/min，10min。吸取上清水相液到第三个离心管，6000r/min,20分钟。倾去溶液，将沉淀用5ml无菌水洗涤悬浮后离心3次备用。

实 验 流 程

吸取静置上清液50ml，15℃低温离心1000r/min,15min。收集上清液与2号无菌离心管。 

将2号无菌离心管加石油醚2ml，振摇1min，4000r/min离心10min。

弃掉醚层，收集上清液与3号无菌离心管。

将3号无菌离心管，10000r/min离心15min。弃去上清液，收集沉淀。

沉淀加5ml PBS悬浮，10000r/min离心5min。弃去上清液，收集沉淀。此步骤进行2次，目的为净化标本。

沉淀物加0.5ml PBS溶液悬浮，吸取0.5ml于无荧光载玻片上捈开与培养箱36±1℃中风干或自然风中风干。

将风干的玻片滴加抗血清0.2ml，置湿盒36±1℃反应30min。

以pH7.2 PBS冲洗，然后浸泡于三缸PBS中，每缸3min并注意振荡。

弃掉PBS，用吸水纸吸干。

滴加荧光羊抗兔抗血清，置湿盒36±1℃反应30min。

以PBS浸洗3次，最后用无菌蒸馏水洗1次，缓冲甘油封片后镜检。

荧光显微镜预热15min，目镜视野绿色荧光亮体为阳性疑似，并计数荧光菌体个数。

6实验方法

6.1间接染色法

6.1.1 本自发荧光对照：已知抗原标本加1-2滴PBS或不加，应无荧光出现。

6.1.2 抗原对照：已知抗原加正常同种动物标记球蛋白溶液染色，应无荧光。

6.1.3 阻抑试验：标本滴加同种未标记抗体感作30min后，再加标记抗体，镜检应无荧光现象。

6.1.4 种属抗原染色：标记抗体与种属抗原标本染色，应无荧光出现。

6.1.5 阳性对照：标记抗体与已知抗原染色，应呈强荧光反应。对照染色可根据条件适当选择。

6.1.6 标本经固定后，于被检标本上滴加已知未标记的抗体（或抗原）置湿盒37℃反应30min。

6.1.7 先以pH7.2 PBS冲洗，然后浸泡于三缸PBS中，每缸3min并注意振荡。

6.1.8 弃掉PBS，用吸水纸吸干。

6.1.9 滴加荧光羊抗兔抗血清，置湿盒37℃感作30min。

6.1.10以PBS浸洗3次，最后用蒸馏水洗1次， 滴加缓冲甘油封片镜检。

6.1.11 荧光点全视野计数即为检出样本中副溶血性弧菌菌量。

6.1.12 O抗原需要高压破坏H抗原后测定，将菌悬液121℃高压20min后用于检测。此检验出阳性图片上菌落为死亡菌，如采用K抗原进行实验则图片菌落为活性菌，需要注意生物安全！

6.1.13 所有检验完成后的图片应该及时投入到盛有次氯酸钠消毒剂的标本缸中浸泡消毒，定期对标本缸中污染载玻片高压消毒。

6.1.14 除测定O抗原高压处理以外的菌体离心物均可以直接用于增菌和免疫磁珠富集分离实验，其获得的培养物鉴定按副溶血性弧菌检验标准执行。

6.1.15 副溶血性弧菌免疫磁珠富集方法按DB32/T    -2010操作。