实验二 过氧化氢的测定

一、实验目的       

1.掌握植物组织中过氧化氢含量的定量测定原理

2.了解H2O2对植物大分子物质的损害机理

二、实验原理

植物组织内积累的H2O2 是由一些氧化酶（主要是超氧化物歧化酶SOD）催化超阳阴离子发生氧化反应而形成。H2O2相对超阳阴离子性质较稳定，但还是一种催化剂，它的存在可以直接或间接地导致细胞膜脂过氧化损害，加速细胞衰老和解体。同时也有积极地一面，如参与植物抗病性和抗逆性的启动和诱导性过程。因此，了解植物组织中H2O2的代谢具有重要意义。

H2O2与硫酸钛（或四氯化钛）反应生成过氧化物——钛复合物黄色沉淀，溶解于硫酸后，在波长410nm出有最大吸收峰，可以进行比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度成线性关系

      TiSO4 + NH3 +  H2O2→  O2-

TiSO4 (TiO2）+ H2O2  →  [TiO(H2O2)2]2↓ + H2SO4

三、实验材料、设备和试剂

1.实验材料：雀麦叶片（经过冰冻的和未经冰冻的）

2.实验设备：研钵、离心管、离心机、试管、容量瓶、分光光度计等等

3.实验试剂： 4°条件下处理的丙酮  5umol/ml H2O2  浓氨水    5% TiSO4  2mol/L H2SO4

四、操作步骤

1.制作标准曲线                                                                

    取7支试管，编号1-7，在通风橱中向各试管加入表1所列试剂，混匀，充分反应后会有沉淀形成，5000r/min,离心5min。留沉淀，弃上清液，并向各试管沉淀中加入2mol/L H2SO4 5ml，摇动，使沉淀完全溶解。以1号试管对照调零，波长410nm处比色测定溶液的吸光度。以吸光度值为纵坐标，过氧化氢物质的量为横坐标，制作标准曲线（图一）。

表1        H2O2浓度标准曲线试剂加入量

称取样品3g，加入3ml预冷的丙酮，在通风橱中冰浴条件下（由于气温低，可以不必使用冰浴）研磨成匀浆后，静置片刻，加丙酮定容至5ml，5000r/min,离心5min。留上清液，并取上清液1ml，加入5% TiSO4 0.1ml，浓氨水0.2ml，出现沉淀后加入2mol/L H2SO4 5ml使之充分溶解，然后进行比色测定。

五、结果处理

 根据溶液吸光度，在标准曲线上查出相应的过氧化氢的物质的量，表示单位为鲜重，计算公式：

过氧化氢含量（umol/g鲜重）=

其中n为标准曲线查得的溶液过氧化氢物质的量（umol），v为样品提取液总体积（ml），vs为吸取样品液总体积，m为样品鲜重（g）

由标准曲线查得的数据和实验所用数据分别为：

冰冻的雀麦叶片 A1 =1.475，n=11.956umol，v=5ml，vs=1ml，m=3g

则：过氧化氢含量 = （umol/g）=19.926（umol/g）

  未经冰冻的雀麦叶片A2=0.921，n=7.422umol，v=5ml，vs=1ml，m=3g

则：过氧化氢含量 =（umol/g）=12.370（umol/g）

结果表明：在寒冷条件胁迫下，雀麦叶片中过氧化氢的含量增加。说明由于体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累，过氧化氢参与了植物抗逆性过程。

六、注意事项

1.丙酮在使用前必须要经过预冷处理，并且在4°的条件下使用。因为，在冰浴条件下丙酮保持4°可以减少丙酮挥发，减少其对人体的毒害，而且可以降低过氧化氢的分解过程。

2.在先后加入5% TiSO4和浓氨水时，要进行摇动，摇动次数和时间应该保持一致，以减少实验误差。

3.根据比色皿的体积，加入硫酸的量要不小于5ml。

标准曲线测定结果

图一