混合醇萃取用以降低林可霉素产品中B组分含量的工艺研究_武斌

混合醇萃取用以降低林可霉素产品中B 组分含量的工艺研究

武斌1 朱家文1 陈葵1 纪利俊1 郭建国1 赵见喜2

(1华东理工大学化学工程研究所, 上海200237;

2湖南岳阳中湘康神药业集团有限公司, 岳阳414000)

摘要: 本文以提高林可霉素产品纯度为目的,研究了以混合高碳醇为萃取剂从发酵液中提取林可霉素

的工艺过程;以混合高碳醇(80%辛醇B 20%癸醇)为萃取剂从发酵液(pH10)中提取林可霉素,常温下12级连续逆流操作时,萃取率可达92.8%;萃取相经过洗涤后,以等当量的盐酸反萃,反萃液经浓缩、脱色和结晶,所得产品中林可霉素B 含量(1.3%)远低于传统丁醇提取工艺产品(4.2%)。在此基础上,还探讨了混合高碳醇萃取和丁醇萃取工艺相结合的可行性,以丁醇提取工艺的林可霉素一次结晶为原料,通过两级萃取和单级洗涤操作,再以盐酸溶液反萃,结晶后产品中林可霉素B 含量小于1.8%,提升了产品质量等级。

关键词: 林可霉素A; 林可霉素B; 萃取; 高碳醇; 选择性中图分类号:TQ460.6 文献标识码:A

收稿日期:2001-10-22 修回日期:2002-01-11

作者简介:武斌,男,生于1967年,博士,副研究员,主要从事生物工程产品分离技术研究。

林可霉素是由林可链霉菌变种所产生的抗生素,对大多数常见的革兰氏阳性菌有抗菌活性,且抗药性发展较慢,对呼吸系统、骨骼和软组织的感染有较好疗

效[1,2]。林可霉素A 的结构式如图1所示。除林可霉素A 外,林可霉素产生菌在一定条件下还产生B 、C 、D 等类似物(表1),除了林可霉素C 的抗菌活性与林可霉素A 相同外,其余都较差,没有实用价值[3]。

国内林可霉素生产厂家发酵产物以林可霉素A 为主,同时也含有约10%的林可霉素B 。林可霉素B 抗菌活力较小,在产品中含量应控制在较低水平。随着林可霉素更多地被作为半合成抗生素的原料来使用,对于降低其中林可霉素B 含量的要求也在提高。从发酵液中提取林可霉素,国内多采用丁醇提取工艺,萃取时对林可霉素B 几乎没有分离作用,产品中林可霉素B 含量较高。为了提高提取收率和产品纯度,一

抗生素 R 1R 2R 3

林可霉素A -SCH 3-CH 3 -CH 2CH 2CH 3林可霉素B -SCH 3-CH 3 -CH 2CH 3林可霉素C -SC 2H 5-CH 3 -CH 2CH 2CH 3林可霉素D

-SCH 3

-H

-CH 2CH 2CH 3

图1 林可霉素的化学结构

直在进行更有效的新提取工艺的研究工作[4,5]。高碳醇对林可霉素A 有较高选择性,以高碳醇为萃取剂,有利于降低产品中林可霉素B 含量[5]

;高碳醇的水不溶性和高沸点,有利于减少溶剂损失。本文以降低产品中林可霉素B 含量为目的,研究了以混合高碳醇为溶剂的提取工艺路线,重点考察了工艺中关键性问题。在此基础上,还验证了保留原丁醇提取工艺,利用混合高碳醇萃取对林可霉素产品进行纯化的可行性。1 材料与方法

1.1 原料

发酵滤液由抗生素生产厂家提供,是放罐后发酵液经酸化后过滤所得清液,化学方法定效价其中含有10%的林可霉素B 。林可霉素盐酸盐标准品由上海市药品检定所提供。

实验中所用的林可霉素丁醇提取一次结晶、二次结晶分别为林可霉素生产厂家丁醇提取工艺的中间产品和成品,其中林可霉素B 的含量分别为5.2%和4.2%。1.2 实验方法

萃取、碱洗、反萃实验在带恒温夹套的分液漏斗中

进行,恒温25e 下操作,振荡10min 以确保达到平衡。根据所需的操作级数,采用多只分液漏斗串联,模拟进行多级逆流实验,直到操作达到稳定为止。

反萃液在旋转蒸发器中进行减压浓缩,温度50~60e ,真空度为5.33~6.67@104Pa 。林可霉素结晶在

真空干燥器中50e 下烘干。

林可霉素和氯化钯在酸性条件下反应生成有色络合物,在380nm 处有明显吸收峰[6]

,利用此性质采用分光光度法分析林可霉素含量(包括A 和B 组分)。测定发酵液效价时,调节发酵液pH11~12,再用正丁醇萃取,取丁醇提取液,用95%乙醇稀释至适当浓度后显色分析。分析有机相中林可霉素含量时,用95%乙醇稀释至适当浓度后进行显色。以林可霉素盐酸盐标准品作标准曲线,样品分析结果以林可霉素A 盐酸盐的形式来表示。

产品中林可霉素B 的含量采用HPLC 分析[2,7],用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;0.05mol/L 硼砂溶液

(用85%磷酸调pH 值至6.0)B 甲醇(4:6)为流动相;检测波长214nm 。

2 结果与讨论

2.1 混合高碳醇为萃取剂的林可霉素提取工艺

以高碳醇为萃取剂从发酵液中提取林可霉素时,由于萃取剂的改变,原先以丁醇为萃取剂提取工艺的条件要发生较大变化:(1)以高碳醇为萃取剂时容易发生乳化,需采取发酵滤液絮凝处理、调节混合醇组成等措施,以解决乳化问题;(2)高碳醇对林可霉素的萃取能力显著小于丁醇,为保证较高的提取效率,萃取级数、相比等有较大改变,洗涤和反萃取等操作条件也有相应变化(图2)

。

图2 混合高碳醇萃取剂提取林可霉素的工艺路线

2.1.1 发酵滤液的絮凝 发酵滤液在放罐后已经进行了草酸酸化处理,去除大量的蛋白质等杂质。由于在偏碱性条件下,高碳醇萃取时易发生乳化现象;为了

减少高碳醇萃取时的乳化,萃取实验前还需对发酵滤液进行絮凝处理,再去除部分蛋白质等表面活性剂杂质。

调节发酵滤液pH 至10.0,加入甲壳素溶液、硫酸铝钾[KAl(SO4)2#12H 2O](用量分别为发酵液的1%和0.2%),用NaOH 溶液调pH 至9.0,絮凝3h;最后再加入NaOH 溶液,调pH 至10.0,过滤除去絮凝沉淀。絮凝过程中效价回收率为98.9%。

甲壳素和硫酸铝钾起絮凝剂作用,使发酵液中剩余的部分蛋白质沉淀析出,有利于改善萃取后的分相情况,减少乳化损失。实验中,减少甲壳素溶液(0.1%~0.5%)和硫酸铝钾(0.05%~0.1%)的用量,析出絮凝沉淀显著减少;增加甲壳素(1.5%~2%)、硫酸铝钾的用量(0.3%~0.4%),过滤所得的絮凝沉淀量没有进一步增加;因此,下文的萃取实验中,发酵滤液按照甲壳素溶液、硫酸铝钾加入量分别为发酵液的1%和0.2%,进行絮凝处理。2.1.2 林可霉素的萃取

(1)混合醇组成的影响 表1所示为不同组成的萃取剂对林可霉素萃取实验结果。水相为二次结晶林可霉素溶液,浓度4000L g/ml,pH=10,有机相由正辛醇(C 8)和正癸醇(C 10)以不同配比混合而成,25e 下萃

取,相比V O /V A =1/3。

表1 混合醇组成对萃取和分相的影响

组成(v/v,%)

D 分相情况 70%正辛醇B 30%正癸醇 2.99 分相速度较快 75%正辛醇B 25%正癸醇 3.12 分相速度一般 80%正辛醇B 20%正癸醇 3.24 分相速度一般 85%正辛醇B 15%正癸醇 3.33 乳化较严重 90%正辛醇B 10%正癸醇

3.51

乳化严重

尽管增加辛醇含量可略微增加有机相的萃取能力,但考虑到分相速度以及对林可霉素A 、B 组分的萃取选择性,下文中萃取实验均采用80%正辛醇B 20%正癸醇的混合配比。

(2)pH 值的影响 在偏碱性条件下,林可霉素容易被从水相萃取入有机相中。以二次结晶林可霉素水溶液调节至不同pH 值,用80%辛醇B 20%癸醇为溶剂进行单级萃取,结果如图3所示。

由图3可见,保持较高pH 值(接近10.0),对萃取操作有利。但过高的pH ,不仅要消耗较多的碱,而且

图3 不同pH 值林可霉素的萃取

(3)温度的影响二次结晶林可霉素水溶液调节至pH10.0,以80%辛醇B20%癸醇为萃取剂在不同温度下进行单级萃取,结果如图4所示。

由图4可见,在较高的萃取温度下(接近60e),可以得到较大的萃取分配比(较常温下高出40%~ 50%),对提高萃取收率有利。但过高的温度会增加溶剂挥发损失,对操作环境污染较大。为了减少溶剂挥发损失,萃取应在较低的温度下进行,同时可以适当增加多级逆流萃取的级数来保证萃取收率。下文中多级萃取、洗涤和反萃取在25e下进行。

(4)林可霉素的多级逆流萃取对酸化后发酵滤液进行絮凝处理,调节pH至10.0,效价为3249L g/ml, 25e下用80%辛醇B20%癸醇进行12级逆流萃取,相比V O/V A=1/3。模拟实验达到稳态操作时,各级有机相和水相中林可霉素的化学效价如图5所示。从有机相出口浓度来计算,12级萃取的提取收率为92.8%。可见,采用12级逆流萃取,可以保证足够高的萃取收

率。

图4

温度对林可霉素萃取的影响图5发酵液中对林可霉素的多级逆流萃取

图5中,在低浓度范围内,D显著减小。林可霉素

浓度对萃取分配比的影响如图6所示。取少量发酵

液,稀释至低浓度范围(306.9L g/ml),调节pH为10.0,

萃取分配比D为2.23,远高于图5中n=12时的D=

0.48。这表明,单是浓度的下降还不足以造成D的减

小;经HPLC测定,混合醇对林可霉素A和B的分离系

数B相当大,在萃取实验浓度范围内,B=3~7;多级逆

流萃取实验中,发酵液中原先含有的少量极性较强的

林可霉素B组分在稀端逐级富集,造成A、B两组分总

分配比D的下降。

2.1.3萃取液碱洗碱洗目的在于除去萃取时进入

有机相中的色素、无机盐、林可霉素B等杂质,以提高

产品纯度。碱洗后水相可与发酵液混合后再进行萃

取,而不影响产品收率。表2所示为不同相比下,模拟

两级逆流洗涤实验的结果,水相为pH10.0缓冲溶液,

25e下洗涤。根据实验结果,以下是较合适的碱洗工

艺条件:以pH10缓冲液在25e下洗涤萃后有机相,两

表2不同相比下萃取液两级逆流碱洗实验

相比

(V O/V A)

洗涤后有机相中效价的保留率

(%)

3.091.7

2.090.8

1.077.3

级逆流操作,V O/V A=2~3;碱洗后水相返回絮凝后发

酵液,再进行萃取。

2.1.4反萃取按化学计量比加入盐酸,可从有机相

中反萃取林可霉素,同时起到浓缩和再生溶剂的作用。

由于高碳醇与水的互溶度较丁醇小得多,与原有丁醇

提取工艺相比(4~6级),反萃的级数可以减少。以稀

盐酸为水相对碱洗后萃取液进行反萃取,有机相效价

为9159L g/ml,水相为pH2.0稀盐酸。V O/V A=3,25e

下模拟3级逆流反萃。末级反萃在搅拌下进行,用

1mol/L盐酸调节pH至2.0~2.5,实验达到稳态时对

各级取样分析,结果表3

所示。

图6混合高碳醇和丁醇萃取相结合的工艺路线

表3

多级逆流反萃

级数水相pH C A (L g/ml)有机相C O (L g/ml)D 1 2.09 21.043.3 2.06 2 2.10 665.253.10.07983

2.29

24600

113.9

0.0046

根据以上结果,反萃取时采用2~3级逆流操作,pH 调至2.0~2.5,相比V O /V A =3~5,可以保证反萃完全。

2.1.5 浓缩、结晶和干燥 浓缩、结晶和干燥条件参照丁醇提取工艺。反萃液减压浓缩至(2.5~3)@105L g/ml,加入活性碳脱色,过滤。滤液中分次缓慢加入9倍体积的丙酮,在4e 下静置充分析出晶体。过滤,固体用丙酮洗涤后,在50e 下真空干燥。干燥后样品经分光光度法测总效价为849L g/mg(林可霉素A 盐酸盐分子式为C 18H 34N 2O 6S #HCl #1/2H 2O,分子量为452,纯品效价为9L g/mg)。用HPLC 法分析,成品中林可霉素B 含量为1.3%,显著低于丁醇提取工艺二次结晶产品(4.2%)。这表明,由于高碳醇对极性较弱的林可霉素A 有较高选择性,利用高碳醇萃取有利于降低产品中林可霉素B 含量;虽然丁醇对林可霉素的萃取能力较强,但萃取选择性较低,成品中仍有较多的林可霉素B;此外,高碳醇沸点较高(>200e ),不溶于水,萃取剂的挥发和溶解损失较小;而丁醇沸点较低(117e ),且溶于水(7.4g/100g 水),萃取后从萃余相中回收溶剂,须消耗较多能量。2.2 丁提和混合醇提取相结合的工艺

在保留原有丁醇提取工艺的前提下,由于市场需求,部分产品需要用混合醇提取工艺进一步加工,以降低林可霉素B 含量,以满足市场上对较高纯度林可霉素原料(林可霉素B 含量小于2%)的要求。为此,研究了混合高碳醇和丁醇萃取工艺结合的工艺条件,初步拟定的工艺路线如图6所示。

2.2.1 萃取 以林可霉素丁醇提取一次结晶配制成不同浓度的的溶液,用氢氧化钠溶液调节pH 至10.0,以混合醇80%正辛醇B 20%正癸醇进行单级萃取(25e ),结果如图7所示。高浓度萃取操作时,分配比D 较正常浓度范围中显著增大;此外,高浓度负载下(C O \\3@105

L g/ml)混合醇粘度很高,这给操作和工艺控制带来困难。选择适当的水相林可霉素浓度,模拟多级萃取实验,结果如表5所示。可见,萃取操作采用两级逆流方式,相比V O /V A =0.5~1,可保证萃取收率

在90%以上。

图7 混合醇萃取林可霉素一次结晶

表4

林可霉素粗结晶的萃取实验

萃取级数

萃取前浓度[C A,O (L g/ml)]

相比(V O /V A )萃取收率(%)153242 1.082.42266560.5.22533860.591.12

106949

1.0

97.4

2.2.2 碱洗 为确保碱洗后有机相中林可霉素B 含量足够低和产品质量达到要求,碱洗需采用较大相比。水相为pH10.0缓冲溶液,有机相浓度为(4~8)@104L g/ml,相比V O /V A =1,25e 下单级碱洗后,有机相中效价的保留率为82.7%~86.2%。

2.2.3 反萃、结晶 碱洗后(单级操作)有机相浓度C O =

3.5~9@104

L g/ml,用1mol/L 盐酸反萃,相比V O /V A =3~11。反萃后水相经减压浓缩,效价范围达到(2.5~3)@105L g/ml,加入丙酮,在4e 下充分析出结晶,晶体经过滤和用丙酮洗涤后,50e ~60e 下减压干燥。对干燥后样品进行分析,化学效价为851L g/mg;用HPLC 法分析,其中林可霉素B 含量为1.29%~1.78%,显著低于丁醇提取工艺一次结晶(5.2%)和二次结晶产品(4.2%)。

在保留原有丁醇提取工艺的基础上,采用混合高碳醇为萃取剂,对丁醇提取所得的林可霉素粗品进行萃取纯化,可以在原有提取设备不作较大改动的前提下,大幅度地提高产品纯度,经济效益显著。对林可霉素B 含量已经较低的一次结晶作进一步纯化,一般需要采取两级以上的连续逆流萃取和碱洗操作;调整萃取、碱洗和反萃操作的级数和相比等条件,可使纯化后样品满足不同纯度要求(林可霉素B [ 1.5%或[0.8%)。3 结论

(1)在优化工艺条件下,以混合高碳醇为萃取剂从发酵液中提取林可霉素,可以显著降低产品中林可霉素B 组份的含量,产品中B 组分为1.3%。随着林可霉素越来越多地用作半合成抗生素的原料,对其中B 组分含量的要求也在提高。B 组分含量小于4%的产

丁醇提取工艺中,萃取剂消耗较大;而对于高碳醇提取工艺,虽然萃取剂成本较高,但挥发和溶解损失小;综合考虑萃取操作成本和因产品价位提高带来的经济收益,混合高碳醇萃取工艺有良好的应用前景。

(2)在保留原有丁醇提取工艺的同时,结合混合高碳醇萃取,对丁提工艺的一次结晶产品(5.2%B组分)进行提纯,成品中林可霉素B含量为 1.29%~ 1.78%。在无须对原工艺的设备进行较大改动的前提下,可以大幅度地降低产品中B组分的含量,提升产品档次和价位。由于以原来的丁醇提取工艺为基础,仅增加少量通用化工设备,投资低,工艺简单,适合于同时生产粗制林可霉素(B组分U3%~4%)和精制林可霉素(B组分[1.5%)的场合。

(3)发酵滤液中加入甲壳素和硫酸钾铝进行絮凝,可使发酵液中剩余的部分蛋白质沉淀析出,从而加快萃取分相速度,减少由于乳化现象而造成的溶剂损失。

符号说明

CA:水相中林可霉素浓度(L g/ml)n:连续逆流萃取级数C O:有机相中林可霉素浓度(L g/ml)V A:水相体积(ml) D:分配比(C O/C A))V O:有机相体积(ml)

参考文献

[1]Pratap V K,Kunwar M,Saxena H,et al.Lincomycin a newer

antibiotic against resistant strains of Staph ylococci[J].Clinician, 1997;41(1):158

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(1995年版,二部)

[S].北京:化学工业出版社,1995:653

[3]俞文和,杨纪根.抗生素生产工艺学[M].沈阳:辽宁科学

技术出版社,1988:387

[4]万钢,于淑秋,伍志春,等.肟类萃取洁霉素的研究[J].化

工冶金,1994;15(4):330

[5]Wu Z C,Xu R F,Chen J Y.Extraction of lincomycin with long-

chain alcohols as solven t[J].Solvent Extr Ion E x ch,1997;15

(3):501

[6]吕孝植,曹松华.分光光度法测定林可霉素[J].医药工业,

1986;17(1):12

[7]Asmus P A,Landis J B,Vila C L.Liquid chromatographic deter-

minati on of lincomycin in fermentation beers[J].J Chromatogr, 1983;2(2):241

Process for preparation of lincomycin with lower content of

component B by extraction with long-chain alcohol

Wu Bin1,Zhu Jia-wen1,C hen Kui1,Ji L-i jun1,

Guo Jian-guo1and Zha o Jian-xi2

(1Chemical Engineeri ng Research Center,Eas t Chi na Universi ty of Science and Technology,

Shanghai200237;

2Yueyang Zhongxiang Kangshen Pharmaceutical Group Co.Ltd.,Yueyang414000)

ABSTRAC T A novel process for e xtrac tion of lincomycin from fermentation broth was studied.A mixture of n-octanol and n-decanol is used as e xtractant to upgrade the purity of the end product.Extraction yield of92.8%was obtained in12-stage counter-current extraction of lincomycin from fermentation broth(pH value adjusted to10)with mixed long-chain alcohol (80%n-octanol B20%n-decanol).The loaded organic phase was scrubbed and then stoichiometrically stripped with hy-drochloric acid.Strip liqour was concentrated,decolorized and mixed with acetone for crystallization of lincomycin.Content of lincomycin B in the final product(1.3%)was much lower than that in product using butano-l extraction process(4.2%). Furthermore,the practicability for c ombination of long-chain alcohol and butanol in purification of lincomycin was investigated. Aqueous solution of primary crystallization product in butano-l extraction process was extracted in two-stage operation and scrubbed in a single stage.The scrubbed organic phase was stripped with hydrochloric acid.Assaying of crystallization product from the strip liquor sho wed a content of less than1.8%of lincomycin B with significant quality upgrading.

KEY WOR DS Lincomycin A;Lincomycin B;Extraction;Long-chain alcohol;Selectivity