结核分支杆菌耐吡嗪酰胺分离株pncA基因突变的研究

结核分支杆菌耐吡嗪酰胺分离株

pncA基因突变的研究

吴雪琼　张俊仙　钟敏　俞伟　丁北川　张军芝　贾树林

【摘要】　目的　了解我国结核分支杆菌耐吡嗪酰胺(PZ A)分离株pncA基因突变情况,研究其与耐PZ A之间的关系。方法　通过聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)和PCR-循环测序法(AS)分析74株结核分支杆菌临床分离株的pncA基因。以结核分支杆菌H37R V标准株为对照。结果　32株药物敏感株pncA基因SSCP分析未发现异常。20株耐非PZ A药物的分离株中,16株pncA基因SSCP泳动正常;4株异常,其中2株测序分析分别为58位密码子TT C→TT A突变和68位密码子TGG→CGG突变。22株耐PZ A分离株中,10株pncA基因SSCP泳动异常,其中2株测序分析均为58位密码子TT C→TT A突变;12株未发现异常。结论　PncA基因突变是结核分支杆菌耐PZ A产生的一种分子机制,通过检测pncA基因突变可快速检测部分结核分支杆菌耐PZ A基因型。

【关键词】　分支杆菌,结核;　药物耐受性;　聚合酶链反应;　多态性,单链构象;　DNA序列分析

Studies on pncA gene mutations in M1tuberculosis isolates　　WU Xueqiong3,ZH ANG Junxian,ZH ONG Min,et al13Tuberculosis Research Laboratory,The309th Hospital,Beijing100091,China 【Abstract】　Objective　T o understand the mutations of pncA gene in M1tuberculosis is olates,and to evaluate their clinical value1Methods　Analyzing the pncA genes in74M1tuberculosis clinical is olates with PCR2SSCP and PCR2AS1M.tuberculosis strain H37R v was used as control1R esults　32drug2sensitive is olates all displayed normal pncA SSCP profile1O f20non2pyrazinamide2resistant is olates,4had abnormal pncA SSCP profile,in which2is olates were sequenced,one was TT C→TT A mutation at codon58,another was TGG→CGG mutation at codon681O f22pyrazinamide2resistant is olates,10displayed abnormal pncA SSCP profile,in which2 is olates sequenced had TT C→TT A mutation at codon581Conclusions　The mutation of pncA gene is a pyrazinamide2resistant m olecular mechanism in M1tuberculosis1Detecting the mutations of pncA genes might diagnose pyrazinamide resistance rapidly in s ome M1tuberculosis is olates1

【K ey w ords】　Mycobacterium tuberculosis;　Drug resistance;　P olymerase chain reaction;　P olym orphism,single2stranded con formation;　DNA sequencing

　　吡嗪酰胺(PZ A)是一种烟酰胺类似物,自1949年首次用于人类肺结核治疗以来,作为第一线抗结核药物已近50年的历史。PZ A是半休眠分支杆菌的杀菌剂,因而可缩短抗结核疗程。目前对PZ A的作用机制了解甚少,它在体外酸性条件(pH510～515)下,具有抗分支杆菌活性,可能PZ A是一种具有抗分支杆菌活性的复合物(如吡嗪酸)的前身,在分支杆菌吡嗪酰胺酶的作用下,在细胞内转变成吡嗪酸而发挥杀菌作用。最近研究[123]表明结核分支杆菌耐PZ A是由于其吡嗪酰胺酶编码基因(pncA)突变,使吡嗪酰胺酶活性丧失,不能将PZ A转变成活性型所致。我们通过聚合酶链反应2单链构象多态性(PCR2SSCP)和PCR2循环测序法(PCR2AS)分析74株结核分支杆菌分离株pncA基因突变,研究pncA 基因与耐PZ A之间的关系。

材料与方法

一、材料

结核分支杆菌标准株来源于中国药品生物制品检定所;74株结核分支杆菌临床分离株来源于山西治医学院附属医院和北京市结核病防治所。

二、方法

11药敏试验:按全国结核病细菌学检验标准化规程进行分支杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验。PZ A药敏试验:将受试菌悬液分别接种于不含PZ A 和含50μg/ml、250μg/ml PZ A的酸性(pH515)琼脂培养基上,37℃培养2～4周。

21细菌DNA的制备:采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA,置-20℃保存备用。

31PCR扩增:PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在1215μl反应体系中,4×dNTP的终浓度各为012mm ol/L,引物(I NS1、2和P1、2、3、4)的终浓度各为013μm ol/L,纯化的DNA模板5～25ng,T aq DNA 聚合酶018U。置DNA热循环仪扩增后,在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。引物I NS1和I NS2扩增结核分支杆菌复合群插入序列IS986产生245bp 片段[4];根据结核分支杆菌pncA基因序列(genebank accession numble U59967)设计的引物P1和P2可扩增该基因32～313位碱基产生282bp片段(pncA上),引物P3和P4可扩增该基因265～512位碱基产生248bp片段(pncA下)。

41SSCP分析:PncA上和pncA下扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,银染色后观察结果并照相。

51测序分析:采用Promega公司生产的Wizard PCR DNA纯化试剂盒提纯PCR扩增产物,然后用Promega公司生产的fm ol DNA测序试剂盒,以P2为测序引物分析pncA上扩增片段。32P-dATP购自北京亚辉生物工程公司,测序电泳后,放射自显影1～3天,肉眼判读结果。

结果

一、PCR扩增

以结核分支杆菌标准株DNA为对照,用引物I NS1和I NS2扩增上述74株结核分支杆菌分离株,均产生245bp片段,进一步证明这些分离株为结核分支杆菌。74株分离株的pncA基因均扩增成功。

二、药敏试验、SSCP分析和AS分析

结果见表1。32株药物敏感株pncA基因SSCP 分析均未发现异常。20株耐非PZ A药物的分离株中,16株pncA基因SSCP泳动正常;2株pncA上基因SSCP泳动异常,测序分析1株为58位密码子TTC→TT A突变(Phe→Leu置换),另一株为68位密码子TGG→CGG突变(Trp→Arg置换);2株pncA下基因SSCP泳动异常。22株耐PZ A分离株中,6株pncA上基因SSCP泳动异常,其中2株测序分析均为58位密码子TTC→TT A突变(Phe→Leu置换);4株pncA下基因SSCP泳动异常;12株pncA基因未发现突变。部分pncA基因AS分析结果见图1。

讨论

PZ A是结核病短程化疗方案中的主要药物之

表1　结核分支杆菌耐药分离株的药敏试验、

PCR2SSCP和PCR2AS结果

所耐药物

PCR2SSCP和部分PCR2AS

pncA上pncA下

分离株数PRHSE+-2

PRHS+-2

PS58位密码子TTC→TT A-2

PRHS-+1

PHS-+1

PS-+1

P-+1

PRHE--1

PRS--1

PHS--2

PH--2

PS--5

P--1

RH68位密码子TGG→CGG-1

HS58位密码子TTC→TT A-1

R-+1

S-+1

非PZ A药物--16

　　注:P:吡嗪酰胺;R:利福平;H:异烟肼;S:链霉素;E:乙胺丁醇;+:SSCP泳动异常;-:SSCP

泳动正常

A、C为结核分支杆菌耐PZ A分离株;B为结核分支杆菌标准株; A68位密码子可见TGG→CGG突变;C58位密码子可见TTC→TT A突变

图1　结核分支杆菌临床分离株pncA基因PCR2AS分析结果一,若结核病患者耐PZ A,其疗效就不理想,疗程必然要延长。因此,化疗过程中也需了解PZ A的药敏情况。目前,传统的药敏试验方法不仅要花费很长时间(1～2月),而且PZ A药敏试验需在酸性条件下进行。常用的改良罗氏培养基不能用于PZ A药敏试验,而BACTEC PZ A药敏试验需用特殊的酸性液体培养基,费用较高。长期以来国内常规开展PZ A 药敏试验的单位很少,也没有统一的方法和判定标准。

最近的研究认为pncA基因突变是结核分支杆菌耐PZ A产生的主要分子机制。PncA基因含有561个核苷酸,目前文献报道[2,3]的结核分支杆菌耐PZ A 分离株pncA基因突变随机分布于整个pncA基因上,大多数为点突变,少数为插入或缺失突变。我们通过PCR2SSCP分析了32株结核分支杆菌药物敏感株的pncA基因均未发现突变,说明该分析具有良好的特异度。在20株耐非PZ A药物的分离株中,发现4株(20%)有不同部位的pncA基因突变,可能系PZ A药敏试验结果不准确所致,需进一步研究。在22株耐PZ A分离株中,仅10株(46%)有pncA基因突变,低于文献报道的突变率,如Sreevatsan等[2]检测了67株结核分支杆菌耐PZ A分离株,72%有pncA基因突变,可能与应用酸性琼脂培养基进行PZ A药敏试验抑制了部分结核分支杆菌分离株在培养基中的生长而出现假阳性结果有关,但该结果证实部分结核分支杆菌耐PZ A是由于其染色体上靶编码基因突变所致。对4株有pncA上基因突变的分离株进行DNA测序,3株为58位密码子TTC→TT A突变(Phe→Leu置换),而Hirano等[3]报道的1株分离株系58位密码子TTC→TTG突变(Phe→Leu 置换),两者系同义突变;本研究中1株为68位密码子TGG→CGG突变(Trp→Arg置换),尚未见文献报道。DNA测序结果说明本组PCR-SSCP检测基因突变的特异性高。我们及Sreevatsan等和Hirano等的研究均发现部分耐PZ A分离株无pncA基因突变,Sreevatsan等还分析了无pncA基因突变分离株的pncA基因上游85bp区域也未发现突变,除了可能是PZ A药敏试验结果不准确外,还可能存在其它耐药机制。非结核分支杆菌虽然具有吡嗪酰胺酶活性,但仍耐PZ A就证明了这一点,也可能是结核分支杆菌减少了吡嗪酰胺酶的转运或增加了酶的流出所致。

总之,通过检测pncA基因突变可快速检测部分结核分支杆菌耐PZ A基因型,弥补常规药敏试验的不足,对临床治疗具有一定的指导意义。

参考文献

1S peirs R J,W elch JT,Cynam on MH.Activity of n2propyl pyrazinoate against pyrazinamide2resistant M.tuberculosis:investigations into mechanism of action of and mechanism of resistance to pyrazinamide.

Antimicrob Agents Chem other,1995,39:126921271.

2Sreevatsan S,Pan X,Zhang Y,et al.Mutations ass ociated with pyrazinamide resistance in pncA of M ycobacterium tuberculosis com plex organisms.Antimicrob Agents Chem other,1997,41:63620.

3H irano K,T akahashi M,K azumi Y,et al.Mutation in pncA is a major mechanism of pyrazinamide resistance in M.tuberculosis.Tuberc Lung Dis,1998,78:1172122.

4吴雪琼,庄玉辉,张晓刚,等1PCR和DNA探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究1中华结核和呼吸杂志,1996,19:372401

(收稿日期:1999204213)

(本文编辑:汪谋岳)