洋葱伯克氏菌作为植物病害生防菌的研究进展及其风险评价

研究进展及其风险评价

张立新,谢关林3,楼妙苗

(浙江大学生物技术研究所,杭州310029)

Risk Assessment to Use Burkholderia cepacia as a Biocontrol Agent of Plant Diseases

ZH ANGLi2xin,XIE G uan2lin,LOU Miao2miao

(Institute of Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou310029,China)

提要:洋葱伯克氏细菌既具有良好的生防功能但又可能是人体条件致病菌,文章就洋葱伯克氏细菌作为生防菌的研究与应用现状及存在的风险进行了综述,同时提出了其作为生防菌的应用前景与急待解决的问题。

关　键　词:洋葱伯克氏细菌;生物防治;安全

中图分类号:S43214;S476　文献标识码:A　文章编号:100529261(2006)0420260205

　　生物防治因具有对环境、生态和人类健康安全等优点,得到了世界各国的广泛重视并已成为研究热点[1,2]。然而,一些来自于土壤或植物根围的生防菌同时也是人体条件致病菌,它们中有一些表现出很强的生防潜能,如洋葱伯克氏细菌(Burkholderia cepacia,简称Bc)具有多种功能,不但用于植物病害防治和促进农作物生长,而且也被用于环境保护、降解土壤中的有毒物质[3,4]。但随着对Bc的深入研究,我们发现一些来自于植物根围的Bc生防菌与医院中分

收稿日期:2006204225

基金项目:国家自然科学基金(30370951)

作者简介:张立新(1978-),男,博士生;3通讯作者,Email:glxie@zju.edu.cn。

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离的致病菌为同一基因型,这意味着植物根围可能是Bc致病菌的天然储存库[5]。因此,Bc作为生防菌应用是否可行值得我们思考。由于该菌涉及医学、农业和环保领域,国内外有关Bc 菌的研究综述已有不少[3～6],但至今尚未见专门论述该菌作为生防菌的风险报道。

1　Bc菌在植物病害生防中的作用及应用情况

　　植物土传病害是一类重要的植物病害,它们通常侵染植物根部,引起植物根部乃至全株的病害,造成重大的经济损失。Bc菌是一种非发酵、革兰氏阴性、能运动、非荧光性细菌,广泛分布于植物根围、土壤和水中。该菌作为生防菌可有效防治多种植物土传病害,如由腐霉(Pythium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和镰刀菌(Fusarium spp.)引起的植物猝倒病。国外有多篇关于该菌在温室条件下有效控制土传病害的报道[4]。作者也曾在菲律宾及国内的水稻上分离到不少Bc菌株,发现它们在离体条件下明显抑制水稻纹枯病菌和恶苗病菌的生长[7]。郑维等[8]从堆肥样本中分离的Bc菌株CF266对立枯丝核菌、尖镰孢(F.oxysporum)以及白假丝酵母(Candida albicans)等表现出了很强的抗菌活性,并鉴定该菌为Bc菌基因型Ⅴ。　　Bc菌还被用来与化学或物理方法相结合防治病害。Omar等[9]发现Bc生防菌c91结合低浓度的杀菌剂carbendazim可明显减轻番茄枯萎病的发生,大大提高了防病效果,也降低了病菌抗药性发生的风险。De C osta等[10]从香蕉表面分离的一株Bc菌株,可有效防治香蕉炭疽病(Colletotrichum musae),并结合热处理方法显著提高了对病害的控制效果,但对其抗生素的成分以及在果实表面定殖能力未做进一步研究。

一些根围Bc生防菌株在温室条件下也可有效防治人参叶斑病(Alternaria panax),但在大田条件下防治效果很差,这可能源于其在叶表面定殖能力弱的缘故。然而,分离于叶围的Bc 菌株则表现出较好地防治叶斑病害的功效,对苹果灰霉病(Botrytis cinerea)、梨青霉(Penicillium expansum)、桃褐腐(Sclerotinia laxa)以及柑橘各种病害的采后病害也有较好的防效[4]。此外, Bc菌也可防治线虫病害,菌株H111能够有效杀死秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)[11]。

“Deny”和“Intercepty”,我国

“T ype Wisconsin”、

　　目前Bc生防菌在美国注册的有“Blue Circle”、

注册的有“亚宝”等[3]。

2　Bc菌的生防作用机制

211　竞争作用

　　竞争作用即生防微生物通过对营养物质的争夺、物理和生物学位点的抢夺等方式控制植物病原微生物的发展。竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制之一。Bc菌是一种强竞争力的根围定殖细菌,在植物根围丰富度较高,如在玉米、水稻、豌豆、向日葵、萝卜、小麦以及棉花等植物根围均有较高的种群密度[12]。我们最新的研究也表明Bc菌是根际优势促生细菌之一,相当一部分菌株具有潜在的生防特性。多项研究表明,Bc菌能够与植物根围的微生物竞争、生存并定殖于其根围,从而有效提高作物产量和抑制土传病害。Nacamulli等[13]发现在玉米根围存在大量其它微生物的情况下,引入的Bc生防菌可以造成根围微生物系统短期紊乱,从而有效地定殖于植物根围。此外,van T ran等[14]从水稻根围分离的Bc生防菌株T VV75能大量定殖于水稻根围,接种稻种时仅有很小比例的菌悬液,在接种24d后,植株根围的T VV75的数量达到107～108cfu/g鲜重,进一步揭示了该菌是植物根围强有力的竞争菌。

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212　拮抗作用

　　生防微生物产生的抗菌物质主要是抗生素,此外还包括细菌素、嗜铁素、胞外裂解酶等。抗生素是微生物产生具有生物活性的物质,在低浓度下能抑制或影响其他生物的机能,从而对敏感微生物产生抑制或致死。其具有天然性、专一性,内吸渗透力强,防病效果稳定的特点[2]。21211　抗生素的种类及作用　能够产生拮抗物质的细菌在自然界中分布很广,它们主要存在于植物的根围或叶围上。Bc菌在植物根围丰富度很高,目前关于其拮抗机制还不十分清楚,但产生的抗菌化合物可直接抑制土传病菌的生长。Bc菌产生多种抗生素,包括硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)、吩嗪(phenazine)、葱假胞素(cepacin)、木假丝菌素(xylocandins=cepacidines)、塞派素(cepaciamide)、假单素(pseudanes)以及其它未鉴定的化合物[4]。

　　研究表明,Bc菌产生的抗生素是植物病害的生防因子。生防菌株AM MDR1将豌豆种子细菌化后,腐霉的游动孢子对豌豆幼苗的侵染及其卵孢子在根部定殖的几率均大大降低;而产抗生素基因的Bc缺失突变菌株1324则不能抑制腐霉对豌豆的侵染。表明抗生素的产生是Bc菌的生防机制之一[15]。Bc菌株515B作为立枯丝核病菌的生防因子,其菌悬液应用于盆栽猩猩木中可有效控制早期该病的发生。进一步研究发现该菌株可产生硝吡咯菌素和吩嗪[16]。　　近年来关于抗生素拮抗机制研究较多的是硝吡咯菌素和吩嗪。硝吡咯菌素是一种绿色带有苯基的化合物,其首次分离于Bc基因型Ⅸ(B.pyrrocinia),后来陆续发现其它生防细菌如荧光假单胞菌(P seudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金色假单胞菌(P.aureo2 f aciens)等也产生该化合物。由假单胞菌和洋葱伯克氏菌产生的pyrrolnitrin对许多人类细菌性和真菌性疾病都具有一定的防治效果,同时抑制多种植物病原真菌包括立枯丝核菌、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)等,尤其对立枯丝核菌抑菌活性显著。其抑菌机制主要是阻碍呼吸链中脱氢酶和细胞色素之间的电子传递从而抑制病菌的生长[17,18]。

　　吩嗪是一种分子量小的水溶性化和物,不同属的细菌如洋葱伯克氏菌、链霉菌(Strepto2 myces)、假单胞菌、海洋细菌(Pelagiobacter)以及弧菌(Vibrio)等均可产生该抗生素。近年来人们发现控制PC A(phenazine212carboxylic acid)产生的基因家族存在两种类型,一类PC A基因已在荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、金色假单胞菌等细菌中发现。另一类PC A基因存在于Bc菌中。利用PC A基因遗传改良生防菌株已初步显示成效。T imms2Wils on等将PC A基因转入荧光假单胞菌S BW25菌株后,该菌株能明显降低豌豆感染白腐病(Pythium ultimum)的程度[19]。但关于吩嗪在植物根围的生物合成以及如何抑制病菌生长的机制还不清楚[20]。

　　优化抗生素的产生条件可以提高防病效果。培养条件如营养因素、温度以及培养基的pH 值均影响抗生素的积累。H wang等[16]发现,Bc生防菌株515B在pH518的NB培养液中产生的pyrrolnitrin要比在pH618中提高46%～58%,且在NB培养基中积累的量优于MS培养基。21212　嗜铁素的种类及作用　自然界中许多微生物产生铁离子螯合剂即嗜铁素,其具有溶解含铁化合物的功能,可以避免铁离子缺少的而得以生存。荧光假单胞菌利用产生嗜铁素增加螯合铁离子的竞争能力从而抑制土传病菌的生长。Bc菌在离体条件下产生4种嗜铁素,包括水杨酸(salicylic acid)、绿脓菌螯铁蛋白(py ochelin)、鸟菌素(ornibactins)和洋葱伯克菌素(cepabactin)[4]。但关于Bc菌产生的嗜铁素定殖于植物根部以及生防的研究较少。

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3　Bc菌在生防应用中的潜在威胁

311　人体条件致病菌

　　Bc菌最初被发现为洋葱的一种致病菌,后来发现在医院环境中常污染各种试剂,引起多种感染病,如败血症、肺炎、心内膜炎和伤口感染等。该菌曾在英国、加拿大等囊性肺纤维化(CF)病人中大流行并导致多人死亡[3]。2005年我国首次报道了总医院收治一例肺部大面积感染Bc菌的病人,最终治疗无效死亡,被确诊为“洋葱伯克氏菌综合症”[21],且在医院临床标本中的分离率逐年呈上升趋势[22]。

312　基因型多样性

　　研究发现,Bc菌不是一个种,而是一组表型相似、基因型不同的细菌群,称为洋葱伯克氏菌复合型。目前已发现9个基因型,其中在医院临床分离较高的为Bc菌基因型II(B.multi2 vorans)和基因型III(B.cenocepacia)[5,23]。近几年人们陆续发现来源于自然环境中的Bc菌株也能够侵染CF患者。例如,最初分离于腐烂的洋葱表皮Bc典型菌株AT CC25416,最近从CF 患者体内也能分离到;同样在美国中部地区的CF患者中频繁分离出的Bc菌基因型IIIPH DC 菌株也存在于该地区的土壤中[5]。Bevivino等[12]从玉米根围分离到大量的Bc菌基因型III B 菌株,该基因型菌株在离体条件下均可抑制串珠镰刀病菌(Fusarium verticillioides)的生长。这无疑增加了自然环境中的Bc生防菌株引起人体致病的风险。

313　基因组的复杂性

　　Bc菌基因组庞大,其大小为4～9Mbp,是大肠杆菌基因组的两倍,且有2～4个复制子,并拥有大量的插入序列,从而很容易允许外源基因的插入而成为突变株[4]。其插入序列编码的蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumef aciens)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)同源性很高。同源性高的菌株间发生染色体重组和基因水平转移的可能性较大,这意味着人体条件致病菌可能来源于无致病性的腐生型细菌[24,25]。

4　Bc菌作为生防菌的应用前景与及待解决的问题

　　Bc菌作为生防菌已表现出优越的生防潜力。20世纪80年代末,几个Bc生防菌递交到美国环保署(EPA)相继登记作为生物农药使用。近几年由于对该菌的研究深入,发现自然环境菌株与医院致病菌株难以区分,这意味着来源于植物根围或土壤的Bc生防菌对人体有潜在的风险,需要重新进行风险评估[3]。近年来不少国家纷纷对Bc生防菌进行了或停用,主要采取的措施有:①使用方式和用量。Bc制剂限用于拌种、沟施,禁止在草地使用,要求Bc菌在作物上的残留量不高于当地自然种群的水平。②撤销登记。BCES M(洋葱伯克氏流行病菌标记)是一种与人体致病性/毒性连锁的遗传标记,对已经注册的Bc菌株一旦发现该类标记的存在,或按说明使用后种群数量不能降低到要求水平一律撤销注册。③禁止使用。日本和不少欧洲国家认为在尚未完全搞清Bc菌的风险之前就应采取禁止使用的措施。

　　当前国内外在尚未搞清Bc菌的致病机制、流行学等特征之前,为避免不必要的风险而采取严格措施完全必要。如上所述,Bc生防菌液直接在田间使用的确存在较大风险。然而,Bc 菌产生的抗生素以及嗜铁素已表现出良好的生防潜能,具有较高的生产应用价值,有必要对其进一步研究和开发。但由于当前对Bc菌抗生素的拮抗机制还不十分清楚,提高其应用潜力

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也有赖于今后的深入研究。随着人类环保意识以及健康意识的加强,新型高效的生物农药代替化学农药是必然趋势,因此开发新型有效的抗生素将是今后研究热点之一。

　　由于Bc生防菌存在对人体致病的风险,因此我国应加强对该菌的全面研究。作者认为: 11对医院引起污染的Bc菌和引起人体致病的Bc菌作详细研究,分析其基因型及致病程度; 21对农业环境中的Bc菌进行生态学研究,明确其基因型及其功能;31对医院和农业环境中Bc菌的致病性及毒力进行比较研究,尤其是来源于植物根围的Bc生防菌与医院致病菌的基因型鉴定及致病性相关程度;41对产生抗生素的Bc生防菌进行研究,明确其拮抗机制,选育和构建安全有效的植物病害工程生防菌株。

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