发酵工程重点

发酵工程：指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程技术体系，是生物工程与生物技术学科的重要组成部分。

高通量筛选：是指将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养后，用计算机记录结果，并进行分析，实现快速、准确、微量的筛选菌株的方法。

细胞工程育种：在细胞水平上对菌种进行操作，采用杂交、接合、转化和转导等遗传学方法，将不同菌种的遗传物质进行交换重组，使不同菌种的优良性状集中在重组体重，从而提高产量。主要有杂交育种和原生质体融合育种。

杂交育种：指将两个基因型不同的菌株经吻合是遗传物质重新组合，从中分离筛选出具有新型性状的菌株。

营养缺陷性标记：微生物经诱变处理后产生的一种突变体，需要在培养基上添加一种特定的有机物才能很好的生存，为筛选该菌株而适当添加的遗传标记。

菌种退化：指生产菌种或选育菌种过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行接种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。

理论转化率：指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，得出转化率大小。

实际转化率：指发酵试验所得转化率的大小。

种子培养：指将冷冻干燥管、沙土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量的纯种的过程。

接种龄：指种子罐中培养的菌丝体转入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

接种量：指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

表观得率：指对底物的总消耗而言的细胞得率。

理论得率：指仅用于细胞生长所消耗底物而言的细胞得率。

呼吸强度：指单位质量干菌体在单位时间内所吸取的氧量。用Qo2表示。

耗氧速率：指单位体积培养液在单位时间内的耗氧量，也称摄氧量。用γ表示。

高密度发酵：指工程菌在短时间内迅速增殖，使菌体浓度迅速升高的过程。

重点部分：

发酵工程技术的发展史

1、1900年以前，自然发酵阶段。酿造生产酒、醋等。2、1900—1940，科赫建立微生物分离纯化和纯培养技术，创造了单细胞纯培养法。3、1940—1950，青霉素大量生产，通气搅拌大规模发酵技术的建立。4、20世纪50年代初，代谢控制发酵技术的建立，生产出核苷酸、抗生素及有机酸等。5、20世纪60年代初，发酵罐形式的多样性，计算机自动控制技术进行发酵参数的自动控制。6、20世纪70年代后，分子生物技术为核心的现代生物技术，基因工程技术，DNA重组技术，大大提高了产量和效率。

工业发酵的类型

按微生物对氧的不同需求分为：需氧发酵、厌氧发酵、兼性厌氧发酵。按培养基的物理性状区分：固体培养基、液体培养基。按发酵工艺流程区分：分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。

发酵生产工艺流程

1、用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制。2、培养基、发酵罐及其附属设配的灭菌。3、扩大培养有活性的适量纯种，以一定比例接种到发酵罐中。4、控制最适的发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物。5、将产物提取并精制，以得到合格的产品。6、回收或处理发酵过程中所生产的三废物质。

微生物菌种的分离筛选

1、样品采集。2、样品的预处理。3、目的菌富集培养。4、菌种初筛。5、菌种复筛。6、菌种发酵性能鉴定。7、菌种保藏。

发酵工业菌种经典的分类鉴定方法

1、形态学特征鉴定，包括菌落特征、细胞形态、细胞大小、细胞排列、特殊细胞结构、染色反应等。

2、生理生化特征鉴定，包括营养类型、对氮碳源的利用能力、对生长因子的需要等。

3、血清学实验与噬菌体分型鉴定，抗原特异性。     4、氨基酸顺序和蛋白质分析鉴定。

常规育种

主要包括诱变和筛选。诱变育种考虑的因素：1、选择合适的出发菌株。2、复合诱变剂的使用，扩大诱变幅度，提高

诱变效果。3、选择合适得诱变剂剂量。4、变异菌株的筛选。

杂交育种的遗传标记：1、营养缺陷性标记。2、抗性标记。3、温度敏感性标记。4其他性状标记。

菌种保藏技术

原理：根据微生物的生理、生化特点，人工的创造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。

方法：1、斜面低温保藏法。2、沙土管保藏法。3、冷冻真空干燥法。4、液氮超低温保藏法。

发酵工业培养基的成分及来源

1、碳源，功能：提供微生物菌体生长繁殖所需的能源以及合成菌体所需的碳骨架；提供菌体合成目的产物的原料。

来源：糖类（葡萄糖、糖蜜、淀粉）、油和脂肪、有机酸、烃和醇类。

2、氮源，功能：主要用于构成菌体细胞物质和合成含氮代谢物。

来源：有机氮源（蛋白质，多肽，氨基酸，尿素）、无机氮源（铵盐，盐，氨水）。

3、无机盐及微量元素，作为微生物生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。蛋白胨。

4、水，微生物代谢反应的内部介质。质量考虑参数：Ph、溶解氧、可溶性固体、矿物组成。

5、生长调节因子，包括生长因子（氨基酸，嘌呤）、前体、产物合成促进剂。

发酵培养基的设计原理

1、确定培养基的组成成分，决定个组分之间的最佳配比。2、菌体的同化能力。3、培养基对菌体代谢的阻遏于诱导的影响。葡萄糖效应。4、碳氮比对菌体代谢调节的重要性。一般碳氮比100：（0.2—2.0）。5、pH对不同菌体代谢的影响。

不同发酵时期染菌对发酵的影响

1、种子扩大时期染菌。主要进行微生物菌体的生长繁殖。种子扩大培养液体积较小，发现染菌，均应灭菌后弃去。

2、发酵前期染菌。积累菌体量，生长繁殖阶段。发现染菌，应迅速重新灭菌，再接种，进行从头发酵。

3、发酵中期染菌。危害大，应早发现，快处理。根据实际情况处理。如抗生素发酵，代谢产物的抑菌作用，可将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的部分体积输入到染菌罐中，来抑制杂菌生长。柠檬酸发酵，如污染细菌，可加大通气量，促进产酸，降低Ph,抑制细菌生长。

4、发酵后期染菌。影响较小，可继续发酵或提前放罐减少染菌造成的损失。

发酵染菌的原因分析

1、从污染杂菌的种类进行分析。⑴污染耐热芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底。⑵污染球菌等不耐热杂菌，可能是种子带菌、空气灭菌不彻底、设备渗漏或操作问题。⑶污染浅绿色杂菌，可能是冷却盘管渗漏。⑷污染霉菌，可能是无菌室灭菌不彻底或无菌操作有问题。⑸污染酵母菌，主要是糖也灭菌不彻底。

2、从污染时间进行分析。⑴发酵前期，可能是种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作不当或无菌空气带菌。⑵发酵后期，可能是中间补料污染、设备渗漏或操作问题。

3、从染菌的程度进行分析。⑴多数发酵罐污染同一种菌，一般是空气系统存在问题，如空气系统结构不合理、空气过滤器介质失效。⑵个别罐连续污染，一般是某个设备存在问题。

杂菌污染的途径及预防

1、种子带菌及其防治：⑴培养基及其器具彻底灭菌。⑵避免菌种在转移过程、培养过程或保藏过程中受杂菌污染。

2、过滤空气带菌及其防治：⑴正确选择采气口。⑵设计合理的空气预处理流程。⑶设计和安装合理的空气过滤器。

3、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治：⑴选择优质材料的设备，定期检查。⑵对“死角”单独彻底灭菌，加强罐体清洗。

4、培养基灭菌不彻底导致染菌及其防治：⑴原料性状的影响，搅拌混匀，加入适当淀粉酶液化，进行实罐灭菌。⑵灭菌温度与压力不对应，打开进气阀、排气阀，边阀，蒸汽通过彻底灭菌。⑶泡沫染菌，添加消泡剂。⑷灭菌时间和压力不够染菌，确保蒸汽恒压，足够灭菌时间。⑸后期罐压骤变染菌，通入无菌空气维持罐压，再冷却。

5、操作不当造成染菌：操作严格规范，防止操作失误引起染菌。

6、噬菌体染菌及其防治：净化环境的综合防治，有净化生产环境、消灭污染源、提高空气净化度、保证纯种培养。

发酵工业的无菌技术

1、干热灭菌法。（电热或红外线）2、湿热灭菌法。（饱和蒸汽）3、射线灭菌法。（紫外线、高能粒子、高能电磁波）4、化学药剂灭菌法。（甲醛、漂白粉、高锰酸钾）5、过滤除菌法。6、火焰灭菌法。

优良种子应具备的条件

1、菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短。2、菌体浓度及总量能满足大量发酵罐接种量的需求。

3、菌种生理状态稳定。4、无杂菌污染，保证纯种发酵。5、菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。

种子质量的判断方法

1、检测种子培养液的pH是否在种子要求的范围内。2、检测种子培养液中的糖、氨基酸、磷酸盐的含量。

3、检测种子培养液中菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观。4、检查有无杂菌污染。

5、其他参数，如接种前某些酶的活力、种子罐的溶氧和尾气。

影响种子质量的因素

1、原材料质量（导致种子质量不稳定）。2、培养温度（影响斜面孢子的质量）。3、湿度（影响斜面孢子的数量和质量）。4、通气与搅拌（保证菌种代谢正常）。5、斜面冷藏时间（影响孢子的生产能力）。6、培养基（种子罐与发酵罐培养基成分相同为好，微生物更好的生长）。7、pH值（菌种生长的最适pH）。

分批发酵的优缺点

优点：操作简单，周期短，染菌机会减少，生产过程、生产质量容易控制。

缺点：不利于测定其过程动力学，使用复合培养基，不能简单的用Monod方程来描述生长。存在底物或抑制问题，采用两种不同类型的底物时，发酵容易出现底物分解阻遏效应及二次生长现象。产率较低。

微生物的耗氧特征

呼吸强度：指单位质量干菌体在单位时间内所吸取的氧量。用Qo2表示。

耗氧速率：指单位体积培养液在单位时间内的耗氧量，也称摄氧量。用γ表示。

γ= Qo2·X，X表示菌体浓度。呼吸强度受菌龄、菌种性能、培养基及培养条件等因素影响。

控制溶解氧的意义

溶解氧浓度对细胞生长和产物合成的影响是不同的，发酵不同阶段，对氧浓度的要求也是不一样的，因此，控制溶解氧对发酵生产非常重要。首先，不同菌种的生长对氧的需求不一样，有好氧微生物，厌氧微生物，兼性厌氧微生物，只有满足适当的氧气的条件，微生物才能生长繁殖好。其次是产物合成受氧浓度的影响。微生物合成代谢产物时，不同微生物所需氧的浓度不同，同种微生物，氧浓度不同，代谢产物也不相同。因此，了解菌体生长繁殖阶段和代谢产物形成阶段的最适耗氧量，控制好溶解氧的浓度，对发酵生产具有重要意义。

氧传质方程

OTR=KLa（C*-CL）。OTR：单位体积培养液的氧传质速率。KLa：以浓度差为推动力的体积溶氧系数。C*-CL：浓度差推动力。

影响氧传递的因素

一、影响推动力的因素：1、温度。2、溶质①电解质（随电解质浓度的增加而增加）②非电解质（随非电解质浓度的增加而下降）③混合溶液。3、溶剂。4、氧分压（提高氧的溶解度来增加氧传质推动力）。

二、影响KLa的因素：1、设备参数（发酵罐的结构，破碎细胞的能力：平叶>箭叶>弯叶，翻动流体能力：箭叶>弯叶>平叶）。2操作条件（搅拌、通气）。3、发酵液性质(表面活性剂、离子强度、菌体浓度)。

发酵过程控制

控制参数：温度、pH、搅拌速率、空气流量、罐压、液位、补料速率及补料量。

直接状态参数：pH、溶解氧（DO）、溶解CO2、尾气O2、尾气CO2、黏度。

间接状态参数：比生长速率（u）、摄氧率（OUR）、CO2释放率（CER）、呼吸商（RQ）、氧体积传质速率（KLa）。

发酵类型：分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。

发酵微生物生长时期：延滞期、对数生长期、衰减期、稳定期、衰亡期。

比生长速率μ ：菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比。

发酵热（Q发酵）：在发酵过程中，引起温度变化的原因是由于发酵过程中所产生的净热量。Q发酵= Q生物+ Q搅拌+ Q通气-Q蒸发-Q辐射

二阶发酵：由于最适合菌体生长的温度不一定适合发酵产物的合成，在实际发酵过程中往往不能在整个发酵周期内仅选择一个最适温度培养，而建立二阶发酵工艺。

变温培养：发酵过程中，不同发酵的阶段，微生物的最适温度不一样，根据微生物的最适培养温度和合成产物的温度，而变化培养的温度，来获得更多产物的一种发酵培养方式。

临界氧浓度：指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。对产物而言，就是不影响产物合成所允许的最低溶氧浓度。

常见DO值（空气饱和度%来表示）:细菌和酵母：3%—10%，放线菌：5%—30%，霉菌：10%—15%。青霉素发酵：5%—10%。

呼吸商RQ值=摄氧率（OUR）/CO2释放率（CER）,反应菌体的代谢情况。

RQ=1，表示糖代谢进行有氧分解代谢途径，仅供生长，无产物形成。RQ>1.1，表示进行EMP途径，生成乙醇。

RQ=0.93，生成柠檬酸。RQ<0.7，生成的乙醇被当做基质再利用。

溶解氧在发酵控制过程中的重要最用

1、溶解氧判断操作故障或事故引起的异常现象。2、溶解氧判断中间补料是否恰当。

3、溶解氧判断发酵体系是否污染杂菌。4、溶解氧作为控制代谢方向的指标。

发酵过程中泡沫的产生和影响及其控制

产生：发酵过程中因通气搅拌于发酵产生CO2以及发酵液中糖、蛋白质和代谢物等产生稳定泡沫，含有复合氮源的通气发酵中产生大量的泡沫。

影响：1、降低了发酵罐的装料系数。2、增加了菌群的非均一性。3、增加了污染杂菌的机会。4、大量起泡，控制不及时会引起“逃液”，导致产物的流失。5、消泡剂的加入有时会影响发酵产量或给下游分离纯化与精致工序带来麻烦。

控制：1、机械消泡，机械搅拌破碎气泡。2、消泡剂消泡。消泡剂特点：①必须是表面活性剂②对气液界面的散布系数必须足够大。③在水中溶解度较小。④无毒，不影响产量和质量。⑤不干扰溶解氧、pH等的使用。⑥来源方便，价格便宜。

高密度发酵：指工程菌在短时间内迅速增殖，使菌体浓度迅速升高的过程。

高密度发酵可以提高发酵罐内的菌体密度，提高产物的细胞水平量，相应的减少了生物反应器（发酵罐）的体积，提高单位体积设备的生产能力，降低生物量的分离费用，缩短生产周期，从而达到降低生产成本，提高生产效率的作用。

发酵罐的类型

1、通用式发酵罐。2、气升式发酵罐。3、管道式发酵罐。4、固定化发酵罐。5、自吸式发酵罐。6、伍式发酵罐。

发酵罐的结构

1、外形、结构及几何装置：液柱高度，筒身高度，发酵罐直径，搅拌器直径，挡板宽度，搅拌器。

2、搅拌的目的：①打碎气泡，增加气液接触面积。②产生涡流，延长气泡在液体中的停留时间。③造成湍流，减小气泡滞留膜的厚度。④动量传递，有利于混合及固体物料保持悬浮状态。破碎气泡：平叶>弯叶>箭叶，翻动流体：箭叶>弯叶>平叶。

3、挡板，改变液流方向，防止涡流形成和提高通气效率。4、消泡器。5、空气分布器。6、装料容积的计算。

7、换热装置，夹层式换热装置用于容积较小的发酵罐。无需进行冷却面的设计。优点：结构简单，加工容易，罐内无冷却装置，死角少，容易清洁灭菌。缺点：传热壁较厚，冷却水流速低，降温效果差。

蛇形管换热装置容积大，优点：冷却水在罐内流速大，传热能力好，热量交换快。缺点：容易形成发酵罐内死角，清洁麻烦。

发酵罐设计的基本要求

1、发酵罐应具有适宜的高径比。2、发酵罐能承受一定的压力。3、发酵罐的搅拌通气装置要能使气泡破碎并分散良好，气液混合充分，保证发酵液有充足的溶解氧。4、发酵罐应具有良好的循环冷却和加热系统。5、发酵罐内应抛光到一定精度，减少死角、污垢，易于彻底灭菌。6、搅拌器的轴封应严密，尽量避免泄露。7、发酵罐传递效率高，能耗低。8、具有机械消泡装置，要求放料，、清洗、维修等操作简便。9、根据实际要求，可以为发酵罐安装必要的温度、溶解氧等控制装置。

发酵罐放大设计及方法

放大三个阶段：1、实验室小试阶段，主要菌种的选育及发酵条件的优化。2、中试阶段，确定放大规律及最佳操作条件。3、工厂生产阶段，通过产业化，评价经济效益。

放大外部条件：1、物理条件：传值能力、传热，混合能力、功率消耗、剪切力。2、化学条件：基质浓度、pH、前体浓度等。

放大方法：1、经验放大法（几何相似法：几何尺寸放大、按空气流量相等准则放大、按搅拌功率相等准则放大。非几何相似法）。

2、量纲分析法。3、时间常数法。

基因工程菌不稳定性的表现和原因及对策

表现：1、质粒的不稳定性。①质粒的丢失。②重组质粒发生DNA片段脱落。2、表达产物的不稳定性。

原因：1、培养基的组成。2、培养温度。3、菌体比生长速率。

对策：1、在质粒构件时，插入一端特殊的DNA片段或基因，宿主细胞时，质粒能稳定的遗传到子代细胞中。

2、在质粒构件时，插入一端能改良宿主细胞生长速率的特殊的DNA片段。

3、所使用的质粒不应带有可转移性因子。4、适当施加环境压力。