毛细管电泳在蛋白质分析中的应用

生技1202 孙丰增 2012304200614

引言

毛细管电泳是将电泳和色谱有机地结合在一起的快速分离技术，具有其分离效率高 ,分析速度快 ,样品用量少 ,容易实现自动化等优点，被广泛应用在生物大分子物质分析中。自从Jorgeson 和 Lukas 于20世纪80年代初创立以来 ,毛细管电泳就很快成为分析化学领域的前沿课题之一。

蛋白质是一切生命活动的基础，是最重要的生物大分子物质，但由于其种类繁多 ,结构复杂 ,样品量少 ,制备、浓缩、分离比较困难 ,用传统分离分析方法效率很低，运用毛细管电泳技术便可以很好解决这些问题。

关键词：毛细管电泳  应用 蛋白质分离  蛋白质分析

正文

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE），将传统电泳技术与现代微柱分离技术有机的结合在一起，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。

电泳力和电渗力是毛细管电泳中带电粒子所受的驱动力。在毛细管电泳中，带电粒子一方面在电场中定向移动，另一方面，溶液表面形成双电层，表面聚集的正电荷由于溶剂化作用，带动毛细管柱中的溶液整体向阴极移动，形成电渗流（EOF）。

图一

与传统的分离分析方法相比,CE具有其独特优点:1.高灵敏度，常用紫外检测器的检测限可达 10-13到10-15mol , 激光诱导荧光检测器则达 10-19到10-21mol;2.高效率,其理论塔板数每米为几十万,高者可达几百乃至千万 ,而高效液相色谱法一般约为几千到几万;3.高速度,最快可在60内完成,有250s内分离 10 种蛋白质的报道 ;4.样品用量少，只需nL级的进样量;5.成本低 ,只需少量( 几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。

影响毛细管电泳分辨率的因素主要有工作电压、溶液PH、缓冲液种类和浓度、离子强度以及毛细管内壁处理。

蛋白质是构成生物体的一类重要的有机含氮物质，是生命的物质基础。蛋白质是由氨基酸组成的，是两性电解质，在一定的PH条件下能解离为带电的基团而使蛋白质带电，在电场中发生定向迁移。

毛细管电泳分离蛋白质的方法主要有：

(1)涂层去活分离蛋白质，如采用甲基纤维素、硅烷、环氧二醇，麦芽糖、聚乙二醇．聚醚、聚丙酰胺等涂层物质。Ren及同事在聚乙烯丙二醇表面再键合环氧树脂，该涂层在pH为4—1l时均稳定，且可减少电渗流，对于碱性蛋白质，分离效率可提高1000倍，而涂层不易损失。

(2)动态分离蛋白质，如采用添加非离子表面活性剂或阳离子表面活性剂，采用高离子强度和两性离子，添加聚乙二醇、二氨基丁烷等其它添加剂。Verzol报导了在1.0mmol精胺存在下，蛋白质与毛细管内壁间的吸附作用可减少90％。Sjodal在分离缓冲液中加入阳离子表面活性剂，可从磷虾的溶解液中分离出50种蛋白质。

(3)其它分离方法，如毛细管串联法、毛细管等电聚焦法、C1TP--CZE串联法、毛细管凝胶电泳法等。

毛细管电泳的分离模式有多种，包括毛细管区带电泳（CZE）、毛细管凝胶电泳（CGE）、毛细管胶束电动色谱（MECC）、毛细管等电聚焦（CIEF）、毛细管等速电泳（CITP）。

目前较为常用的主要为毛细管区带电泳和毛细管凝胶电泳。

1.毛细管区带电泳

毛细管区带电泳(CZE)是基于被分离物质的荷质比差异，在电场力作用下在缓冲溶液中的迁移速度不同，以使各组分达到分离。它是毛细管电泳中最简单、最基本、使用最广泛的分离模式，通常把它看成其它各种分离模式的母体。CZE法是根据被分析物的质荷比不同, 将其分离。所以对于那些结构相似,但电荷不同的多肽蛋白,可以通过调整pH值,改变溶质电荷,改变淌度,使其得以分离。一系列在所有 pH条件下具有相同净电荷但大小不同的多肽,可以利用CEZ很容易分开, 并且效率很高 (N=110000 ～17 000 0)。Messana用CZE分离红细胞中亚硝基谷胱甘肽，亚硝基谷胱甘肽可与还原及氧化的谷胱甘肽分离并定量测定。李克等研究了CZE分离人血清蛋白质的电泳行为，并建立了分离血清蛋白质的CZE方法。

但分离带正电荷多肽蛋白的一个 主要问题是它们容易吸附到石英毛细管内壁上,导致峰形变宽,区带变形,分离效率低,重复性差。 目前有以下几种方法可减少吸附：

1.1使用低 pH 缓冲液。

1.2选择pH值高于等电点的缓冲液。

1.3向电解质溶液中加入碱金属离子缓冲液中加入高浓度两性离子。

1.4缓冲液中加入高浓度两性离子。

1.5使用中性亲水性物质对管壁进行化学改性以遮掩硅羟基。

1.6向缓冲液中加入阳离子表面活性剂。

1.7运用外加电场,可直接控制电势和电渗流,从而可控制多肽蛋白的管壁吸附。

2.毛细管凝胶电泳

毛细管凝胶电泳(CGE)是将凝胶电泳对生物分子的高效分离能力与毛细管电泳的快速、微量和定量相结合。其原理是基于被测组分的荷质比和分子体积不同而进行分离。

目前，毛细管凝胶电泳(CGE)绝大多数局限于蛋白质分子量的测定,  测定过程中蛋白质需被变性处理, 很少有应用CGE分离分析活性蛋白质的报道，然而，现代生命科学最重要的是分离具有生物活性的的蛋白质，并对其进行分析。

例如：使用一种或两种混合的部分交联聚丙烯酰胺凝胶(semi-CPAs)进行非变性蛋白质的CGE分离, 不仅实现了碱性蛋白质的基线分离, 同时发现这种材料具有良好的动态涂覆毛细管内壁的能力。

由于包括蛋白质在内的各种生物大分子的复杂特性, 仅凭借单一分离介质无法解决所有生物分离问题,因此开始不断有混合使用聚合物溶液或者应用共聚物的报道。有实验配制了含两种具有不同单体或不同交联剂浓度的混合semi-CPAs 凝胶, 对其分离能力进行了初步考察.

对应蛋白分别是溶菌酶(1)、细胞色素C(2)、核糖核酸酶A(3)和胰蛋白酶(4)

结果表明,5%T- 0.4%C和2%T-0.4%C的凝胶溶液混合使用后,最难实现分离的溶菌酶和细胞色素C的分离度由原来单一凝胶体系下的4.4提高到5.4, 并且最慢出峰的胰蛋白酶的柱效也显著改善(图2). 其原因是由于混合凝胶体系在没有发生黏度增大的同时,  形成了更为精细、宽孔径范围并具有一定弹性的凝胶筛分孔穴, 因此与蛋白质分子的选择性相互作用进一步增强。

3.芯片毛细管电泳

芯片毛细管电泳技术将常规的毛细管电泳操作在芯片上进行，利用玻璃、石英或各种聚合物材料加工微米级通道，以高压直流电场为驱动力，对样品进行进样、分离及检测。它与常规毛细管电泳的分离原理相同，因此在分离生物大分子样品方面具有优势。此外，与常规毛细管电泳系统相比，芯片毛细管电泳系统还具备分离时间短、分离效率高、系统体积小且易实现不同操作单元的集成等优点。芯片毛细管电泳的上述优点使其成为蛋白质分离分析中的重要手段之一。

展望与分析

毛细管电泳被广泛应用在蛋白质分析中，尤其是毛细管电泳芯片技术及联用技术的出现，使得高通量分析分析技术微型化成为现实，具有广阔的发展前景 但是CE仍然具有需要改进的地方，首先是解决蛋白质易吸附的问题。其次，与HPLC相比，CE在重现性方面的效果仍然不是很理想。最后，CE在样品制备方面存在很大的缺陷。毛细管电泳技术还有很大的发展空间。

引用文献