生物化学实验基本操作-实验报告

一、实验目的

1、熟悉化学类实验室的基本常识、规则、安全及防护知识。

2、掌握基本实验操作及常用仪器的使用方法。

3、通过实际操作，进一步掌握理论知识，能完成真个实验的设计、操作及计算。

二、实验仪器与试剂

1、实验器材

（一）蛋白质的定量测定

1、实验原理

Bicinchoninic acid (BCA)法是近来广为应用的蛋白质测定方法。即在碱性环境下，蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值，并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

 2、实验方法

（1）、工作溶液（Working Reagent,WR）的配制：

将50体积BCA Reagent 与1体积Cu Reagent 混合即为WR工作试剂，呈嫩绿色。

（2）、标准蛋白溶液配制：

用双蒸水与待测蛋白样品匹配之缓冲液进行倍比稀释：40μl 4000μg/ml BSA+60μl 稀释溶液（H2O）=100μl（BSA=1600μg/ml）,从中取出50μl连续倍比稀释，得到BSA标准溶液1600、800、400、200、100、50、25μg/ml,各50μl。

（3）、蛋白测定

蛋白质浓度线性检测范围为10-2000μg/ml。微板测定用96孔板，反应终体积225μl，用酶标仪测定。

a.微板测定：用加样器将25μl标准品与200μl WR工作液混合于微板孔中。

b.37℃恒温反应30min。

c.将反应管温度冷却至室温，测定562nm（实际测定波长为570nm）光密度（OD）值。

d.绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度（μg/ml）,轴为各标准管对应的OD值。绘制excel拟合曲线。

3、实验结果

（1）、微板测定方案实验数据

 4、结果讨论

（二）PBS缓冲液的配制

1、0.2M Na2HPO4 ：称取7.16g Na2HPO4-12H2O，溶于100ml水。

 0.2M NaH2PO4 ：称取3.12g NaH2PO4-H2O，溶于100ml水。

2、各种浓度PB（pH=7.4）:

先配0.2M PB（pH=7.4,100ml）:取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4，81ml 0.2mol/L的Na2HPO4，测得溶液pH低于7.4，滴NaOH至pH计测得pH=7.4即可。

   然后，只需将0.2M PB（pH=7.4）按相应比例适当稀释即可，如：

   0.1M PB（pH=7.4）：取50ml 0.2M PB,加水稀释至100ml即可。

0.01M PB（pH=7.4）：取5ml 0.2M PB,加水稀释至100ml即可。

0.02M PB（pH=7.4）：取10ml 0.2M PB,加水稀释至100ml即可。

3、加入NaCl至0.9%（g/100ml）即可。