抗凝血药物研究进展

抗凝血药物研究进展

Ξ

赵荣乐,李保卫

(北京师范大学生命科学学院,北京100875)

摘　要:按凝血过程激发、放大、凝血酶和纤维蛋白形成的顺序,从原理、临床试验、到作为抗栓塞新药应用对目前国内外抗凝血药物的研究进行了详细评述.

关键词:抗凝血药物;凝血因子;血栓;血小板;凝血酶

中图分类号:R972+.6　　文献标识码:A　　文章编号:10062432X(2005)0320045204

　　血液中存在着相互拮抗的凝血系统和抗凝血系统.在正常生理状态下,血液中的凝血因子不断地被激活,从而产生凝血酶,形成微量纤维蛋白,沉着于血管内膜上,但这些微量的纤维蛋白有不断地被激活了的抗凝血系统所溶解,同时被激活的凝血因子也不断地被单核吞噬细胞系统所吞噬.凝血系统和抗凝系统的动态平衡,既保证了血液有潜在的可凝固性,又保证了血液的流体状态.然而,有时在某些能促进凝血过程的因素作用下(如心血管内膜的损伤、血液状态的改变和血液凝固性增加),上述动态平衡被打破,触发了体内凝血过程,导致非正常凝血或凝血过程被无放大,血液便可在心血管腔内凝固,形成血栓.

血栓在现代社会中是一种主要的致死性疾病,目前已有的抗栓药物主要有抗血小板药物阿司匹林(Aspirin)和噻氯匹定(Ticlopidine);抗凝药物肝素(Heparin)和华法林(Warfarin).这些药物在治疗血栓性疾病方面有一定的作用,但也存在很大的缺陷.主要表现在三个方面:较高的心血管死亡率、引起出血和需要医院或实验室监控.考虑到这些抗血栓药物的不足,人们从各个途径出发寻找新的、更有效的抗血栓药物.

1　Ⅶa/组织因子途径抑制剂

由于凝血过程是由Ⅶa/组织因子复合物激发,因此阻止该激发过程引起了人们注意.主要着眼于三个方面,即组织因子、Ⅶa和Ⅶa/组织因子复合物.组织因子抑制剂主要是利用其抗体使其失活,利用变异物以及其肽不同片断竞争性地与Ⅶa结合抑制其作用.活性位点被抑制的Ⅶa(被称为Ⅶai)能竞争性地与组织因子结合.在狒狒脓血症模型中,Ⅶai能减轻凝血和提高存活率;在灵长类和兔子血栓模型中它具有抗血栓活性.Ⅶa活性位点抑制剂在此是一起起重要作用的决定子,因为活性位点被D2Phe2Pro2Arg2CH2CL抑制的Ⅶa与组织因子的亲和力比天然Ⅶa提高了5倍.

Ⅶa/组织因子复合物抑制剂有三类:天然存在的抗凝物TFPI,线虫类抗凝血蛋白家族(研究最清楚的是NAPc2)以及最近研究的合成抑制剂.TFPI 是一Ⅹa依赖的FⅦa抑制剂,只有很少量的TFPI 以游离状态循环或储存在血小板中,大多数的TF2 PI与脂蛋白一起或结合到血管内皮上.当使用肝素或低分子量肝素时,全长的TFPI从血管内皮释放出来,其原因可能是这些药物取代TFPI结合到了血管内皮的糖胺聚糖上.添加FIV时,TFPI被一种未知的蛋白酶迅速降解为大的片断.对猪的体外实验表明:TFPI可减弱受伤引起的新血管内皮增生和抑制平滑肌细胞迁移;狒狒和兔子脓血症模型中,TFPI可减弱凝血过程和增加存活率.因为这些作用TFPI作为治疗脓血症药物已进入Ⅲ期临床试验.线虫类抗凝血蛋白家族是分离自钩虫带有蛔虫类蛋白酶构象的一类小蛋白.这类蛋白有的直接抑制FⅩa,其他的(如NAPc2)则直接结合到F Ⅹ或FⅩa的非催化位点,抑制Ⅶa/组织因子复合物中FⅦa的活性.NAPc2皮下注射后有长达50小时的半衰期,功能上NAPc2像TFPI一样,在实

Ξ收稿日期:2004210208

作者简介:赵荣乐(19452),女,北京师范大学教授,主要从事生物化学研究.验室动物模型中发现它可以减弱脓血症导致的凝血.NAPc2作为选择性膝关节手术病人的血栓预防药物已经进入Ⅱ期临床试验阶段.

2　Ⅸa和Ⅹa因子抑制剂

2.1　Ⅸa抑制剂

缺乏Ⅸ导致血友病B显示了Ⅸ在血液凝固过程中的重要作用.抑制Ⅸa的策略主要集中在活性位点阻抑和针对Ⅸ/Ⅸa的抗体两个方面.活性位点被抑制的Ⅸa(Ⅸai)通过与IXa竞争性形成内源性酶复合物来抑制后者的活性,在狗模型中Ⅸai可以阻止冠状动脉血栓的形成,这同时也说明了抑制Ⅸa的抗凝物可以调节血栓.针对Ⅸ/Ⅸa的单克隆抗体中,一种Ⅸa抗体可阻止Ⅹ的激活,其他的则同时抑制Ⅸ和Ⅸa的活性.据Christopher P.Rus2 coni等人报道,一种RNA apatmer Peg29.3t和它的解毒剂522作为Ⅸa的抑制剂和解毒剂成为一类的抗凝药物,其动物试验和临床试验即将进行.

2.2　Ⅹa抑制剂

直接和间接Ⅹa抑制剂都在研究中.直接Ⅹa 抑制剂与Ⅹa的活性中心结合而抑制其活性,主要包括天然抑制剂和合成药物两类,天然的如TAP (tick anticoagulant peptide)、Antistasin、Lefaixin 等,合成的如DX29065a、YM260828和SK549.与肝素和低分子量肝素相比,Ⅹa抑制剂可以同时灭活结合到磷脂表面和游离的Ⅹa,而前者则必须依赖抗凝血酶发挥作用,并且对结合到血小板上的Ⅹa 没有抑制作用.一种与肝素五糖顺序类似具有调节肝素和抗凝血酶相互作用的合成五糖是新发现的Ⅹa间接抑制剂,它被用于预防和治疗静脉血栓已进入Ⅲ期临床试验.

2.2.1　直接Ⅹa抑制剂

分离自吸血动物的天然Ⅹa抑制剂有TAP、Antistasin、Lefaxin.TAP最早分离自一种软虱(Or2 nithodoros moubata),现已人工表达.TAP是一60个氨基酸组成的多肽,与水蛭素和凝血酶相互作用类似,TAP是专一性的强Ⅹa抑制剂.TAP与Ⅹa 的结合分两步,先和Ⅹa的非活性位点(该位点类似于凝血酶的暴露位点Ⅰ)发生低亲和性相互作用,然后再和活性位点发生高亲和性相互作用形成稳定的TAP2Ⅹa复合物.作为合成的非肽类低分子量可逆Ⅹa抑制剂,DX29065,YM260828,SF303和SK549用于试验动物血栓模型是十分有效的. DX29065目前被用做治疗间歇性心绞痛已进入Ⅱ期临床阶段,作为DX29065的类似物,YM260828已对松猴试验证实可以口服,同时对兔子试验证实SK549也可以口服.2.2.2　间接Ⅹa抑制剂

合成五糖由于对抗凝血酶(Antithrombin)有更高的亲和性,因此与肝素和低分子量肝素相比合成五糖对FⅩa有更高的抑制活性.因为五糖分子短小不能连接凝血酶和抗凝血酶,因而提高了抗凝血素对Ⅹa的灭活率,但是对凝血素抑制率没有影响.对该药进行每天一次皮下注射的临床观察,取得了令人鼓舞的结果.合成五糖与低分子量肝素对静脉血栓的预防和治疗比较已经进入Ⅲ期临床试验.

3　凝血酶抑制剂

3.1　间接凝血酶抑制剂

间接凝血酶抑制剂主要包括肝素和硫酸软骨素,其中肝素通过结合到抗凝血酶发挥作用.经过改良的未分级肝素和低分子量肝素作为预防和治疗静脉血栓的药物已被广泛使用.由于低分子量肝素比起肝素有可预测的抗凝效果和不需药后观察而被广泛应用于医院外病人,并且迅速确立了其在治疗间歇性心绞疼方面的地位.最近随着新输送方法的出现,已经有了口服的肝素和低分子量肝素.这些输送方法是用合成的氨基酸如SNAC(sodium N2(8[22hydroxxybenzoyl]amino)caprylate)或SNAC的衍生物来促经肠道对肝素的吸收.虽然吸收是有限和不定的,但口服足量的肝素可以延长APTT(激活的部分凝血酶原时间).该方法临床Ⅰ期Ⅱ期试验已经完成,正在进行的Ⅲ期临床试验是比较SNAC/肝素和低分子量肝素对臀或膝关节手术病人血栓预防的应用效果.

硫酸软骨素B通过激活肝素辅因子Ⅱ发挥抗凝作用,DiCarlo.V等人曾将它与低剂量肝素相比较来观察其在癌症病人血栓预防中的效果.由于它的低选择活性和很差的可溶性,了这种皮下注射药物的使用,它也未被列入临床试验.最近制成的一种低分子量的硫酸软骨素可以改善其皮下注射后的生物活性,而且各种物理方法也被用来提高其专一活性.

3.2　直接凝血酶抑制剂

与肝素相比,直接凝血酶抑制剂有许多潜在的优点.结合到纤维蛋白或纤维蛋白降解产物上的凝血酶不能被肝素抑制,却容易被直接凝血酶抑制剂抑制;直接凝血酶抑制剂不与其他血浆蛋白结合使其比肝素有可预测的抗凝药物反应;直接凝血酶抑制剂不被血小板释放的一种高度富含阳离子的肝素结合蛋白2血小板因子4中和.直接凝血酶抑制剂虽然都能与凝血酶直接结合,但它们的作用位点是不同的,主要包括以下几种.

・

6

4

・　　　喀什师范学院学报第26卷3.2.1　水蛭素及其衍生物

水蛭素能与凝血酶形成1∶1的复合物,它们迅速结合,但解离缓慢.这种几乎不可逆的复合物使水蛭素作为抗凝药物有一致命的缺点,就是没有相应的解毒药时会引起出血.水蛭素几乎不经过肝代谢,主要被肾脏清除,使用FⅣ(凝血分子Ⅳ)后其在血浆内的半衰期是40分钟,皮下注射的半衰期大约为120分钟.水蛭素已被成功地用于治疗伴随有肝素引起血小板减少的静脉和动脉血栓患者,其用于治疗肝素引起的血小板减少症在北美已经获得批准.另外用于臀或膝关节手术病人血栓预防,水蛭素优于低剂量皮下注射肝素或低分子量肝素,而且没有增加出血风险到高危险级别.用于间歇性心绞痛和non2ST2elevation心肌梗塞,水蛭素效果明显好于肝素,尽管它也增加了病人出血的风险性,但没有达到威胁生命的程度.批准水蛭素作为间歇性心绞痛和non2ST2elevation心肌梗塞治疗药物也正在进行中.

Bivalirudin是一种半合成的二价凝血酶抑制剂,它的结构为:四肽(D2Phe2Pro2Arg2Pro)活性位点抑制剂+能与凝血酶纤维蛋白原识别位点结合的水蛭素C末端类似物十二肽+连接区四个甘氨酸.不象水蛭素,Bivalirudin对凝血酶活性位点的抑制是短暂的,一旦结合到凝血酶上,其N端的Pro2Arg就被裂解,使Bivalirudin变为一个与凝血酶低亲和的抑制剂.Bivalirudin的短半衰期使它比水蛭素更安全,它与肝素相比较治疗冠状动脉血管形成(coronary angioplasty)已进入Ⅲ期临床试验,在此方面Bivalirudin有可能替代肝素.仅有部分Bivalirudin被肾脏直接排出,推测肝代谢其他位点的蛋白裂解有助于Bivalirudin在体内的清除.

3.2.2　其他天然凝血酶抑制素

最近新发现的其他天然直接凝血酶抑制剂有几十种.如来源于毒蛇的Bothrojaracin是一个二价的凝血酶抑制剂,除了结合到凝血酶暴露位点Ⅰ2纤维蛋白原结合位点,而且能与凝血酶暴露位点Ⅱ2肝素结合位点结合.另外还有Haemadin、Theramin、TTI(tsetse thrombin inhibitor)、Rhodiin、Triabin、Dipetalin、Ornithodorin、Americanin、Ixin、Savignin和Bothroalternin,它们有的直接与凝血酶活性位点结合,有的同时结合到暴露位点和活性位点.这些天然凝血酶抑制剂上尚未进行临床试验观察.

3.2.3　非共价抑制剂

人们研究发现一些小分子能与凝血酶的活性位点非共价结合,从而成为凝血酶的竞争性抑制剂,Argatroban是这类选择性凝血酶抑制剂的典型代表.Argatroban是羧酸衍生物,它作为药物和肝素交替使用来治疗肝素引起的血小板减少症已获得批准.其他同类抗凝物有Napsagatran,Inoga2 tran,Melagatran,L2372236和L2372460.其中最令人鼓舞的是Melagatran和L2372460的前体———可以口服的H376/95.H376/95是一不带电荷的亲脂性药物,它本身对凝血酶没有活性,当被胃肠道吸收后迅速转化为有抑制活性的Melagatran.该药具有可预测的抗凝药物反应,几乎不需要试验检测.将H376/95用于预测和治疗静脉血栓的Ⅱ期临床试验已经完成,现已进入Ⅲ期临床试验.

非共价凝血酶抑制剂用于试验动物动脉和静脉血栓模型是非常有效的,但用于人类所获的数据是有限的.尽管这些非共价凝血酶抑制剂没有已经证实的解毒剂,但Napsagatran的抗凝作用可被S205A2thrombin中和.S205A2thrombin是一重组凝血酶突变体,其活性位点的丝氨酸被丙氨酸取代.S205A2thrombin与Napsagatran的亲和结合类似天然凝血酶,但它没有酶的活性,而且它的中和抑制效果是短暂的.

3.2.4　共价抑制剂

PPAC K(D2Phe2Pro2Arg chloromethyl ketone)是一类能与凝血酶形成共价化合物的人工合成三肽的典型代表.PPAC K通过烷化凝血酶活性中心的丝氨酸而发挥不可逆的抑制作用,PPAC K的主要缺陷是它缺乏选择性.硼酸衍生物如DU P7714比PPAC K的选择性好,但抑制补体因子Ⅰ,另外这些药物会引起严重的低血压.

最令人鼓舞的共价抑制剂是精氨酸衍生物E2 fegatran(D2MePhe2Pro2ArgH),它能与凝血酶缓慢形成一可逆共价复合物.Ⅳ处理后Efegatran有一短的半衰期而且是可口服的.其他两种可口服的精氨酸衍生物药物S18326和CVS21123.

3.2.5　与凝血酶结合的DNA aptamers

能与凝血酶结合的双链DNA aptamers(一段DNA序列,与基因的DNA作用元件相似,能够与凝血酶结合)已经确定.另外一单链15核苷酸DNA aptamer,它能够高亲和地结合到凝血酶地暴露位点Ⅰ,体外实验表明它是一强有效的抗凝药物,动物实验也证实具有抗血栓活性,然而仅有几分钟的半衰期了它的使用.最近能与凝血酶暴露位点Ⅱ结合的DNA aptamer也被发现,由于凝血酶暴露位点Ⅰ与暴露位点Ⅱ直接存在变构连接,结合到暴露位点Ⅱ的DNA aptamer能影响结合到暴露位点Ⅰ的配基.针对暴露位点Ⅱ的DNA ap2 tamer已经在实验室进行了动物实验,但与其他DNA aptamer一样,体外实验表明它们的半衰期也

・

7

4

・

第3期赵荣乐,李保卫:抗凝血药物研究进展　　

很短.

4　 a 抑制剂

a 是凝血酶激活的转谷氨酰酶,它能交叉连接纤维蛋白原的α和γ链分别形成α2多聚体和γ二聚体,使纤维蛋白交叉成不溶的纤维蛋白网络,最终导致血栓.一些能与 a 活性位点作用的药物和钙螯合物能够抑制 a ,然而这些化合物缺乏专一性,能同时抑制其他谷氨酰转移酶,而且半衰期短.Tridegin 是一种分离自巨大亚马逊蛭(Haementeria ghilianti )的一种 a 专一抑制多肽,体外试验表明,纤维蛋白凝固前加入Tridegin 可以减弱纤维蛋白凝固.一种来源于蛭的交叉连接水解酶Destabilase ,能够逆转 a 导致的纤维蛋白交叉过程.参考文献:

[1]S ohn J H ,K ang H A .Current status of the anticoagu 2

lant hirudin :its biotechnological production and clinical practice [J ].Appl Microbiol Biotechnol ,2001,57:6062613.

[2]Michel Salzet .Anticoagulants and inhibitors of platelet

aggregation derived from leeches [J ].FEBS Letters ,2001,492:1872192.

[3]Zavalova L L ,et al.Fibrinogen 2Fibrin System Regulators

from Bloodsuckers [J ].Biochemistry (Moscow ),2002,67(1):1352142.

[4]Paolo Gresele ,G iancarlo Agnelli.Novel approaches to the

treatment of thrombosis [J ].Trends Pharmacol Sci ,

2002,23(1):25232.

[5]Butenas S ,Mann K G.Blood Coagulation [J ].Bio 2

chemistry (Moscow ),2002,67(1):3212.

[6]K athiresan M D ,et al.Argatroban [J ].Journal of

Thrombosis and Thrombolysis ,2002,13(1):41247.[7]Y in C Lin ,Ressell F Doolittle.A Latent Inhibitor of Fib 2

rin Polymerization with Ancillary Anticoagulant Activity [J ].Thrombosis Research ,2000,97:3752378.

[8]Wong P C ,et al.Nonpeptide factor Xa inhibitors :I.

Studies with SF303and SK549,a new antithrombotic [J ].J Pharmacol Exp Ther ,2000,292:3512357.[9]Michel Salzet.Anticoagulants and inhibitors of platelet

aggregation derived from leeches [J ].FEBS ,2001,492:1872192.

[10]Michel Salzet ,et al.Theromin ,a Novel Leech Throm 2

bin Inhibitor [J ].THE Journal of Biologicl Chemistry ,2000,275(40):30774230780.

[11]John L Richardson ,et al.Crystal structure of the hu 2

man a 2thrombin 2haemadin complex :an exosite 22bind 2ing inhibitor [J ].The EMBO Journal ,2000,19(21):565025660.

[12]Weitz J I ,Crowther M.Direct thrombin inhibitors

[J ].Thrombosis Research ,2002,106(3):2752284.[13]S ohn J H ,et al.Current status of the anticoagulant

hirudin :its biotechnological production and clinical practice [J ].Appl Microbiol Biotechnol ,2001,57:6062613.

[14]Ofosu F A.The Blood Platelet as a Model for Regulation

on Cell Surfaces and Its Consequences [J ].Biochemistry (Moscow ),2002,67(1):47255.

[15]Enrico D I ,Angelene M.Determinants of Thrombin

Specificity [J ].Ann N Y Acad Sci ,2001,936:1332146.

R esearch Progress on Anticoagulant Drugs

ZHAO Rong 2le ,L I Bao 2wei

(College of Life sciences ,Beijing Normal University ,Beijing 100875,China )

Abstract :Two types of anticoagulant drugs can inhibit the thrombosis ,the drug anti -platelet prevents the activation and agglutintion of platelet ,drug of anticoagulant inhibits the formation of thrombin and fibrin.This paper reviews the research progress of new antocoagulant drugs from the mechanism clinical experiment to the application.

K ey w ords :Anticoagulant ;Coagulant factors ;Thrombosis ;Platelet ;Thrombin

・84・　　　喀什师范学院学报第26卷