小鼠胚胎细胞的原代与传代培养及观察

南京师范大学生命科学学院 09070150 唐嘉艺

摘要：细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可以分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚从活体组织中分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后的传代培养创造条件。

传代培养是组织培养常规保种方法之一。当细胞在培养在培养瓶中长满之后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代培养要在严格的无菌条件下进行。

本次实验主要是为了培养能进行细胞的原代和传代培养的能力，熟练掌握进行细胞原代与传代培养的条件、实验材料、方法等。

关键词：小鼠胚胎 原代培养 传代培养 无菌

前言：在体外培养中，有三个培养层次，即细胞培养、组织培养和器官培养。细胞培养是指从体内取出组织，经消化酶消化成单细胞或细胞群，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使细胞生存和生长并维持其结构和功能的方法。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外生长，必须满足一下的基本要求：

一、供给细胞存活所必需的营养条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气等。

二、要有适合各种细胞生长的适宜温度，并注意细胞生长环境的酸碱度与渗透压的调节。

三、细胞培养必需严格控制在无菌条件下。细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。

培养细胞所用器材及试剂：

1、设备

（1）超净工作台

（2）滤器

（3）CO2培养箱

（4）电热干燥箱

2、器械及器皿：培养瓶、培养皿、滴管、镊子、手术剪

3、培养液：目前常用的基础培养基均已商品化，如RPM10，MEM，M—199等，可根据培养需求合理选择。

血清：一般常用为小牛血清，人血清和其它动物血清。

平衡盐溶液：主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。常用的有PBS，Hank’s等。

抗生素：常用为青霉素和链霉素。

其它添加成分：缓冲系统，常用为HEPES，在20。C时为7.55，37。C为7.31；HEPES不是起维持PH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速PH变化的，所以调整PH常常用NaHCO3溶液。有机补充物，如丙酮酸钠，谷氨酰胺等。促细胞因子，如生长因子类的FGF，EDF。贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。

细胞培养的基本方法：

1、组织、细胞的解离方法

1.1解离组织：在无菌情况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液（BSS）中，然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理。

解离时应注意：尽可能将脂肪和坏死组织去除干净；剪碎组织时，避免损伤组织块；解离组织时，避免损伤组织块；解离组织用的各种酶系，需要先进行低速离心。

1.2解离细胞：可用酶和螯合剂进行解离。常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶，胰蛋白酶解离所需时间短，主要缺点是会使细胞破损；胶原酶解离细胞方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。螯合剂解离细胞法的分离效果差。另外还有机械解离细胞法，虽然比酶法所需时间短，但细胞存活率较低。

细胞培养中应注意的几个问题：

1、培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不嫩盲目增加每单位体积的细胞浓度。

2、PH：初培养PH应为7.4，培养过程中应不低于7.0。

3、培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1：10。

实验材料：

怀孕母鼠，取鼠胚胎，可在开放实验室内操作。处死后打开腹腔，取出子宫，不打开子宫黏膜，连子宫一同放入培养皿内，放入洁净间。

实验方法及步骤：

1、原代培养

1．1 取材：取怀孕母鼠，颈椎脱臼法处死后，整个鼠体浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟。取出母鼠在不锈钢手术盘中用无菌手术剪打开腹腔，取出鼠胚，放入无菌培养皿内。注意取材可在无菌操作台外操作。

1.2 用70%酒精擦拭装有鼠胚的培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台上，用含双抗的Hanks液洗涤鼠胚数遍去除血污。用无菌手术器械去除头、尾和四肢及内脏，余下组织用剪刀剪碎后，再用含双抗的Hanks液洗涤数次。最后用含血清的细胞培养液清洗。

1.3 把组织块剪成1mm3左右大小于培养液中，用无菌胶头吸管吸取组织块，注意要吸在专用的细胞长吸管前端细长部位，如吸得过高，可使组织小块粘附于管壁而无法吹出。组织块应均匀贴附于细胞培养瓶的底部，注意组织块间要留有空间，不要太密。

1.4 翻转培养瓶，使贴附组织块的细胞培养面朝上，在培养瓶底加入细胞培养液3-5ml，不要加得太多以免培养液漏出产生污染。旋好瓶盖后在培养瓶侧用油性笔写上培养时间。细胞培养瓶放于CO2恒温培养箱中，温度为37℃，CO2浓度为5%，完全湿度条件下进行培养，以利组织块贴附。

1.5 2-3小时后，可见组织小块略干燥，牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使细胞培养液缓慢浸泡组织块，继续培养。操作过程中动作一定要轻缓，以免贴附在瓶壁上的组织块脱落，影响贴壁培养。然后将培养瓶置于37。C培养箱培养2～3天。

2、传代培养

2.1 如无菌室前先酒精擦拭消毒双手。

2.2 将原代培养的培养瓶倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代培养。

2.3 用酒精棉球擦净操作台，点燃酒精灯，将培养瓶口灼烧消毒。

2.4 倒掉培养瓶中的旧培养基，留下贴壁生长的细胞。

2.5 在培养瓶中加入胰酶至刚好漫过贴壁生长的细胞即可，盖上瓶盖，将培养瓶置于37。C的培养箱中5分钟。在此期间，如果在显微镜下观察可以看到细胞收回突起变成圆形。

2.6 取出培养瓶，轻轻摇晃培养瓶是细胞脱离瓶壁，悬浮在胰酶液中。

2.7 将培养瓶中的悬浮液倒入新的培养瓶中，并向培养瓶中加入5ML含血清的新鲜培养液，终止消化并将培养瓶置于37。C培养箱中培养，此时细胞可以继续而传代。

实验结果观察与分析：

1、理论上培养3-4天后，可见细胞从组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片而形成单层细胞。细胞在瓶底可长成致密的单细胞层。在倒置显微镜下进行观察，细胞多数是梭形的成纤维细胞，也有少数多角形的上皮细胞。这种细胞是具有能力的细胞，证明原代培养成功，可以接着进行传代细胞的传代细胞的培养。

  实际上，当我去观察的时候，培养液已经变成黄色，细胞悬浮在培养液中，这表明培养液的PH已经发生变化，细胞已经失去能力了。而正常的应该是培养液为桔红色，细胞贴壁生长。这可能的原因是：没有每隔一段时间对培养瓶中细胞的生长状况进行观察，以及采取及时的处理，在这期间细胞可能由于，刚开始时细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸而呈黄色，而在此期间并没有及时更换培养液而导致细胞不易贴壁生长，逐渐死亡。还有可能是因为生长因子、CO2浓度等外界条件与体内的环境有差异而导致细胞不能正常生长。此外，在细胞培养过程中需要氨基酸、无机盐、维生素、葡萄糖等各种营养条件，这些因素的其中一个发生变化都会是的细胞的生长停止，而导致实验的失败。但是本次实验中并没有出现污染问题，说明在实验操作的过程中能够保证严格的无菌环境。

  当在显微镜下观察细胞形态时发现，多数细胞已经失去能力了，而好的细胞应该呈现长梭形，立体感强。因此，这些细胞不能用于传代细胞的培养。

2、理论上，在显微镜下可以观察到梭形的细胞说明传代培养成功。和原代培养的观察类似。但是总的来说，我们实验室的实验结果不是很好，观察到的好的细胞很少。其原因可能和原代培养时候的相近。

对于不能进行传代培养的细胞我们进行了活性的观察实验。用台盼蓝染液染色，取9滴细胞液+1滴台盼蓝，染色不超过3分钟，在显微镜下观察可以发现，有的细胞核被染成蓝色，而有的细胞核没有着色。这是因为细胞核被染色的细胞是死细胞，而未被染色的则是活细胞，通过这个实验可以计算视野中细胞的存活率。

参考文献：

   李素文，细胞生物学实验指导.北京，高等教育出版社，2001.

   翟中和，王喜忠，丁明孝，细胞生物学.北京，高等教育出版社，2007.