葡萄酒理化指标测定新技术

摘要：葡萄酒一般清亮、晶莹、透明、有光泽，具有令人愉悦的外观和回味无穷的内涵，而葡萄酒这一系列属性都来源于葡萄酒自身的理化指标。正确的理化指标测定方法不仅可以提高科学依据，并且能大大的节约测定员的时间。

关键词：葡萄酒；二氧化硫；白黎芦醇;ABTS;

中国是世界葡萄发源地之一。公元前138 年汉朝张骞出使西域，将葡萄和酿酒技术传入内地，自此历代各朝均有生产，并有众多赞颂葡萄酒的诗、词、歌、赋，绵延流传，构成了独具异彩的中华酒文化。然而，对于葡萄酒理化指标的测定，却总墨守成规。特别是生产过程中，仅从固定的几个指标中采用固定的方法进行测定。本文选取了近年来研究者们对葡萄酒几个理化指标的新方法进行讨论。

一 固相萃取-离子色谱法测定葡萄酒中二氧化硫

    二氧化硫是一种无色、有刺激气味的气体，对食品有漂白和防腐作用，是食品加工中常用的漂白剂和防腐剂。一般来讲，二氧化硫随着食品进入体内后生成亚硫酸盐，并由组织细胞中的亚硫酸氧化酶将其氧化为硫酸盐，通过正常解毒后最终由尿排出体外。因此，少量的二氧化硫进入机体可以认为是安全无害的。但超量则会对人体健康造成危害。为此国家标准[1]

    GB/T 5009.34-2003 规定了食品中亚硫酸盐的检验方法，有盐酸副玫瑰苯胺分光光度法和蒸馏法，这些方法均为化学法，已延用许多年，试剂和标准配制繁琐，且试剂和标准放置一段时间后结果重现性差，作为液相色谱法的分支-离子色谱技术近些年来在食品、空气、水质检测方面的研究越来越广泛，国内外在前处理方面多以蒸馏或吹扫捕集后以碳酸钠或氢氧化钠或双氧水或碳酸钠、碳酸氢钠混合液进行吸收二氧化硫后进离子色谱测定，前处理方法也较为烦锁而且由于二氧化硫易挥发有些方法样品回收率不高。[2-5]

李良，王晴根据待测样品和仪器的实验情况以碳酸钠为淋洗液，用C18 柱分离后过0.45μm 滤膜过滤定容后直接进样，用离子色谱法测定葡萄酒中二氧化硫，方法简便易行，操作时间大为缩短。

材料与方法

1 材料与仪器

Dionex ICS-90 离子色谱仪：配有DS5 电导检测器，膜抑制器 Dionex AMMS® III-4mm，Peknet 色谱工作站，Ionpac®AS9-HC 分离柱，Ionpac®AG9-HC 保护柱，美国戴安公司；GL Science 固相萃取装置，岛津技迩科技公司。Variant C18 分离柱 规格：100MG 1ML，美国瓦里安公司；二氧化硫标准 国家环保总局标准样品研究所，浓度为100μg/mL；葡萄酒 南昌市工商局抽检样品； Na2CO3 天津化学试剂研究所，基准；H2SO4 国药化学试剂有限公司，分析纯；实验用水为电阻为18MΩ的高纯水。

2 色谱条件 采用等浓度淋洗法，淋洗液为9mmol/L Na2CO3（水溶液，再生液为C（1/2

H2SO4）=20mmol/L，流速为1mL/min,进样量为10!L，柱温为室温，进样时间间隔为30min,

以保留时间定性，峰面积定量。

3 样品测定 准确称取1g 左右（精确至0.01g）葡萄酒，过C18 固相萃取柱（样品可

先过柱后再加入少量9mmol/LNa2CO3 水溶液洗脱样品）分离除去部分非极性有机物质后经

0.45!m 滤膜过滤加入9mmol/LNa2CO3 水溶液定容至10mL 进样。

4 计算公式：

                        X =   C * V / m

X：葡萄酒中二氧化硫的含量（mg/kg）;C:测得的二氧化硫浓度（mg/L）;

V１：溶液定容体积（mL）; m: 葡萄酒的称样量(g)

在国内外文献报道中多以碳酸钠或氢氧化钠或双氧水或碳酸钠、碳酸氢钠混合液进行吸收二氧化硫后进离子色谱测定，虽用氢氧化钠吸收效果较好，但由于本实验中采用碳酸柱不宜用氢氧化钠作吸收液，采用双氧水氧化二氧化硫法是测定生成的硫酸根，葡萄酒在配制工艺中本底有一定量的硫酸根，故对测定二氧化硫值较低的样品不够准确，根据实验情况李良，王晴以9 mmol/L Na2CO3作为淋洗液,用固相萃取-离子色谱法测定了葡萄酒中二氧化硫含量，方法较国标简化，省去了配制试剂和标准标定的时间，提高了工作效率。并且采用了国家标准物质和仪器进行检测，测定方法灵敏度和准确度大为提高，检出限低于国标的20 倍。此方法中只利用常用的C18 柱前处理即可完成，前处理液不仅可以测定葡萄酒中二氧化硫，而且其他饮料类物质中二氧化硫和盐、亚盐类物质也可进行类似同时测定，此方法的建立可以为国家标准方法中将离子色谱纳入液体食品中二氧化硫的测定提供了方法依据。

二 葡萄酒中白黎芦醇含量测定与分析

葡萄酒特别是红葡萄酒含有较多的多酚类物质及其衍生物, 这类物质不仅使葡萄酒具有特有的口感、香味及颜色, 而且对饮用者的健康有着良好的促进作用, 它们能有效地清除自由基、抑制红细胞膜和低密度脂蛋白的脂质过氧化、促进内皮细胞松弛因子NO 的形成, 防止血小板凝聚, 从而具有抗氧化、抗菌消炎、抗癌、抗衰老、抗辐射、降脂、防止动脉粥样硬化等作用。大量流行病学资料有证据支持适量饮用红葡萄酒与冠心病的发病率呈负相关, 能够明显减少其死亡率[6] 。

白黎芦醇( resveratrol) , 化学名称为芪三酚( 3,4,5- tr ihydrox ystilbene) 是红葡萄酒中多酚类化合物之一, 其生理活性作用日益受到人们的重视。为了解国产红葡萄酒中白黎芦醇含量以及不同去除葡萄酒中乙醇方法对白黎芦醇含量的影响, 朱明元, 周光宇, 黄忆明对市售8 种品牌红葡萄酒中白黎芦醇含量进行了测定。

材料与方法

1 仪器 LC- 6A 高效液相色谱仪, LC- 6A- ECD 电化学检测器( 日本岛津) , C18 分析柱( 迪马公司200 @ 4. 6 mm) , HW- 2000 色谱工作站( 南京千谱软件有限公司) 。

2 色谱条件 流动相: 20 mM 醋酸钠( pH4. 1) B甲醇= 60B40, 流速1. 0 ml/ min, 柱温43 e , 电化学检测器电压0. 75 V。

3 样品 市售红葡萄酒8 种, 其中4 种为干红葡萄酒, 4 种为甜红葡萄酒, 4 种干红葡萄酒经蒸馏除乙醇和40 e 水浴24 h挥发除乙醇。

4 样品处理 样品经0. 45 Lm 膜过滤后直接进样。

5 白黎芦醇标准品 白黎芦醇标准品购于Sigma 公司, 纯度> 98%, 用甲醇配成10 Lg/ ml。

6 统计分析 采用SPSS11. 0 统计软件包建立实验结果数据库, 以ŠX±SD 表示定量指标的平均值和分散程度。采用T检验比较样本均数, 显著性水准为A= 0. 05。

三 ABTS 法测定葡萄酒抗氧化活性的研究

经过研究和分析发现, 葡萄酒中含有大量的多酚类物质, 如白藜芦醇、儿茶酚、表儿茶精、槲皮酮和芸香苷等, 这些多酚类物质具有抗氧化活性, 除了抑制低密度脂蛋白的氧化、预防心血管疾病以外, 还有抗癌、抗炎症和抗血小板凝聚等功能[7] , 但不同的品种、气候、地理条件和工艺措施, 导致葡萄酒中酚类物质在数量和种类上都有明显不同[8-9] 。因此, 如何评价葡萄酒中酚类物质的抗氧化活性很有现实意义。

ABTS 在414, 5, 734 和815 nm 处均有特征吸收[10] 。Miller 等[11] 在1993 年首次介绍了用ABTS 法来评价一些化合物的抗氧化活性, 即根据待测化合物清除ABTS 引起的吸光度变化来评价其抗氧化活性。此后, ABTS法成为一种被广泛采用的抗氧化活性测定方法, 用于饮料和食品以及一些植物提取物抗氧化活性的测定,同时也被广泛用于测定葡萄酒的抗氧化活性[ 12] 。但众多研究者未明确提出测定的最佳条件, 不同的研究者采用的样品稀释方案和反应时间也不相同, 使所得数据难以比较。一些研究者运用ABT S# + 法研究了酚类标准品浓度对其抗氧化活性的影响[13] 。在此领域, Yu 等[ 14] 找到了标准品浓度与其抗氧化活性的线性关系, 即抗氧化活性与其浓度的增加呈正相关; L pez-V lez 等[15] 研究发现,4 种葡萄酒酒多酚纯品的浓度与抗氧化活性呈正相关, 但很少有人以混合物为材料进行研究。此外, 抗氧化活性也与反应时间有关, 一些研究者只设定几个时间点进行分析, 而有些研究者观察、检测整个反应时间的动力学曲线[16] 。这两种方法共同的缺点是没有考虑最佳反应时间, 研究者采用不同反应时间得到的T rolox 等价抗氧化能力TEAC( T rolox Equivalent Antioxidant Capacity , 以1 L 葡萄酒的ABTS清除能力以达到相同自由基清除能力所需T rolox 的量表示) 各不相同, 而且对ABTS和葡萄酒样品的反应曲线还不明确。

李华,李勇,吴莹,王华对ABTS法测定葡萄酒抗氧化活性的反应时间和样品稀释倍数进行研究, 以确定ABTS法测定葡萄酒抗氧化活性的最佳反应时间和葡萄酒的最佳稀释倍数。

材料与方法

1 材料、试剂与仪器

供试36 种葡萄酒样品由国内11 个厂家提供,其中红葡萄酒23 种, 桃红葡萄酒3 种, 白葡萄酒10种。A BT S [ 2, 2c-Azino2bis2 ( 3-ethy lbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ] 、Trolox ( 6-hydrox y-2, 5, 7, 8-Tetramethy lchroman-2-carboxylic acid) 和没食子酸( Gallic acid) , 均为Sigma 公司产品; 其他化学试剂均为国产分析纯。MV-1700 紫外可见光分光光度计, 由上海精密科学仪器有限公司生产。

2 总酚含量的测定

参照王华[17] 的方法, 利用福林肖卡比色法( FC)测定总酚含量。福林试剂的配制: 称取20 g 钨酸钠和5 g 钼酸钠于圆底烧瓶中, 用140 mL 蒸馏水溶解, 加入体积分数85%的磷酸溶液10 mL 和浓盐酸20 mL, 文火回流2 h, 然后加入3 g 硫酸锂及15 mL 溴水, 加热沸腾15 min 至亮黄色, 不得带微蓝和绿色。冷却,移入250 mL 容量瓶中, 定容, 贮于棕色瓶中。将待测葡萄酒样100 LL 加入10 mL 试管中,加入7 mL 蒸馏水, 摇匀, 再加0. 5 mL 福林试剂, 充分摇匀, 1 min 后, 加入20 g/ L 碳酸钠溶液1. 5 mL,混匀, 最后加入0. 9 mL 蒸馏水。避光反应60 min后, 于765 nm 波长下比色, 测定吸光度, 每处理重复3 次, 结果以没食子酸质量浓度表示, 单位为/ mg / L0。没食子酸标准溶液质量浓度为0, 50,100, 150, 250 和500 mg/ L。

3 ABTS 法测定葡萄酒的抗氧化活性

3. 1 反应物配制和葡萄酒样品的稀释 

( 1)Trolox 标准品的配制。用无水乙醇配制成5mmol/L Trolox 标准品储备液, 使用时再用无水乙醇稀释成若干不同浓度, 使其分别具有5% ~ 85%的自由基清除能力, 根据预试验结果, 合适的Trolox 标准溶液浓度为0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,1.2, 1.4, 1.6 和1.8mmol/L。

(2) ABTS 工作液的配制。将5mL 7mmol/L ABTS 和88 LL 140mmol/ L 过硫酸钾溶液混合, 在室温、避光条件下静置过夜, 形成ABTS储备液,该储备液在室温、避光的条件下表现稳定, 使用前用无水乙醇稀释成工作液, 要求其在734 nm 波长下的吸光度为0. 70± 0.02。

（3) 葡萄酒样品的稀释。选择总酚含量具代表性的葡萄酒样品, 根据预试验结果, 将其用蒸馏水稀释成若干浓度, 稀释倍数( 葡萄酒样品体积与稀释后总体积之比) 分别为: 红葡萄酒0. 1 B10~ 1 B 10, 桃红葡萄酒0. 5 B10~ 5 B 10, 白葡萄酒1 B 10~ 1 B 1。

3. 2 最佳反应时间的确定 选取红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒样品各1 种, 取50 LL 稀释后的葡萄酒样品, 置于1mL 具塞试管, 加入4mL ABTS 工作液, 立即开始计时, 随即摇匀, 反应2~10 min, 734 nm 波长下测定吸光度, 每处理重复3次, 不同稀释倍数样品逐一试验, 分析反应动力学曲线以确定最佳反应时间, 再测定最佳反应时间的TEAC 值, 单位为“mmol/L”。

3. 3 最佳稀释倍数的确定 试验操作同1. 3. 2,待试样品为所有选取葡萄酒各个稀释倍数的稀释液, 反应时间为1. 3. 2 确定的最佳反应时间, 不同稀释倍数的葡萄酒样品与ABTS 工作液反应, 若稀释倍数在某一区间内与测定的吸光度之间线性相关,此区间的稀释倍数即为葡萄酒最佳稀释倍数。

3. 4 数据处理 试验数据以“平均值±标准差”表示, 采用SPSS 软件进行方差分析, 总酚与抗氧化活性的相关性分析采用EXCEL 数据分析中的相关系数分析程序处理。

结语

在中国葡萄与葡萄酒产业取得快速发展的同时，对于葡萄酒各项指标的测定正在越来越完善与科学。只有在完善的检测之后，消费者们才能放心的对葡萄酒进行需求，使葡萄酒品尝者通过葡萄酒品尝，怡神悦意、净化心灵、完善人格、激励斗志、升华境界。

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