转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体

植物中的转录因子有相当一部分与抗逆性有关。转录因子参与渗透胁迫的信号转导或功能基因表达，在植物抗渗透胁迫反应中起关键作用。它们在转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆功能基因同时表达，获得比单独导入某个功能基因更强的抗逆性。到目前为止，真正被学术界广泛认可的，同时也是近年来被研究得最多的是转录因子ＤＲＥＢ［３］所的信号路径。ＤＲＥＢ是个小基因家族，编码３个相关的转录活化因子。ＤＲＥＢ１Ａ是这个小基因家族的重要成员之一，最早是在拟南芥中被克隆并鉴定的［４］。研究发现，它对抗渗透胁迫基因的启动起着“主开关”的作用，在逆境胁迫下主动相关基因的表达，并在胁迫信号传递中起重要作用。

目前大多采用传统的方式进行植物表达载体的构建，而Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术是一种新的通用型载体构建方法，由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司开发，该技术基于λ噬菌体位点特异性重组原理［５］，可以在不同的克隆载体之间实现ＤＮＡ片段的转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。Ｇａｔｅｗａｙ技术由ＢＰ和ＬＲ两个反应组成，

文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０２０５－０４研究报告转录因子ＤＲＥＢ１Ａ基因的克隆与Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术构建植物表达载体

佟友丽，赵飞，冯君伟，李玉花

东北林业大学花卉生物工程研究所，黑龙江哈尔滨１５００４０

［摘要］目的：研究转录因子ＤＲＥＢ１Ａ在植物抗渗透胁迫反应中的作用，并探讨利用Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术构建植物表达载体的方法。方法：根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的ＤＲＥＢ１Ａ基因的全长ｍＲＮＡ序列设计引物，克隆了拟南芥的转录因子ＤＲＥＢＩＡ基因。根据Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术的要求，设计含有ａｔｔＢ接头的引物，利用高保真的ＰｌａｔｉｎｕｍｐｆｘＤＮＡ聚合酶，通过ＰＣＲ方法在克隆基因的两端加上Ｂ序列。通过ＢＰ反应将包含有ａｔｔＢ接头的ＰＣＲ产物克隆到含有ａｔｔＰ的ｄｏｎｏｒ载体上以产生Ｅｎｔｒｙ克隆，通过ＬＲ反应将已经重组入Ｅｎｔｒｙ载体的ＤＲＥＢ１Ａ基因再克隆到ｐＨ２ＧＷ７双元载体。结果：对重组载体ｐＨ２ＧＷ７－ＤＲＥＢ１Ａ的鉴定结果表明成功构建了ＤＲＥＢ１Ａ基因的植物表达载体。结论：利用Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术构建植物表达载体简便易行，该结果为遗传转化研究奠定了基础。

［关键词］转录因子ＤＲＥＢ１Ａ；Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术；植物表达载体

［中图分类号］Ｑ７８［文献标识码］Ａ

ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＤＲＥＢ１ＡＧｅｎｅａｎｄＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｂｙＧａｔｅｗａｙＣｌｏｎｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅ

ＴＯＮＧＹｏｕ－ｌｉ，ＺＨＡＯＦｅｉ，ＦＥＮＧＪｕｎ－ｗｅｉ，ＬＩＹｕ－ｈｕａ

ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｌｏｗｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００４０，Ｃｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｒｅｓｅａｒｃｈｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｔｈｅＤＲＥＢ１ＡｇｅｎｅｉｎｐｌａｎｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓａｎｄｔｏｄｅｖｅｌｏｐｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｗａｙｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｂｙＧａｔｅｗａｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄａｃ－ｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｍＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＤＲＥＢ１ＡｇｅｎｅｉｎＧｅｎＢａｎｋｄａｔａｂａｓｅｓ，ＤＲＥＢ１ＡｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｗａｓｃｌｏｎｅｄ．ＴｗｏｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｔｔＢａｄａｐｔｅｒｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｓｅｐａｒａｔｅｌｙｂｙＧａｔｅｗａｙｃｌｏｎｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＰｌａｔｉｎｕｍｐｆｘＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｗｈｉｃｈｃａｎｒｅｄｕｃｅｔｈｅｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇｇｒｅａｔｌｙｗａｓｕｓｅｄｄｕｒｉｎｇｔｗｏＰＣＲｉｎｗｈｉｃｈａｄｄｉｎｇＢｓｅｑｕｅｎｃｅｔｏｔｈｅｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅ．ＢｙｔｈｅＢＰｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｔｔＢｗａｓｔｒａｎｓｆｅｒｅｄｔｏａｎａｔｔＰ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｄｏｎｏｒｖｅｃｔｏｒｔｏｃｒｅａｔｅａｎｅｎｔｒｙｃｌｏｎｅ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ＤＲＥＢ１ＡｇｅｎｅｗａｓｓｈｕｔｔｅｄｉｎｔｏｐＨ２ＧＷ７ｖｅｃｔｏｒｂｙＬＲｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｒｅ－ａｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｐＨ２ＧＷ７－ＤＲＥＢ１Ａｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕ－ｓｉｏｎ：ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｔｉｓｅａｓｙｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｂｙＧａｔｅｗａｙｃｌｏｎｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄｉｔｐｒｏ－ｖｉｄｅｓｂａｓｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｉｓｇｅｎｅ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ\\ＤＲＥＢ１Ａ\\Ｇａｔｅｗａｙｃｌｏｎｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ\\ｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ

［收稿日期］２００６－０８－２１

［基金项目］国家高技术研究发展计划项目（２００６ＡＡ１０Ｚ１２９）；

东北林业大学校立科研基金资助项目

［作者简介］佟友丽（１９７６－），女，博士研究生，讲师

［通讯作者］李玉花，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｌｙｈｓｈｅｎ＠ｍａｉｌ．ｈｌ．ｃｎ

ＬＰ反应与ＢＲ反应方向相反，其基本过程（图１）可以简单表示

为：

ＢＰ反应：ａｔｔＢ×ａｔｔＰ→ａｔｔＬ＋ａｔｔＲ；ＬＲ反应：ａｔｔＬ×ａｔｔＲ→ａｔｔＢ＋ａｔｔＰ。

我们从经低温处理的拟南芥中克隆了ＤＲＥＢ１Ａ基因的

ｃＤＮＡ，并应用Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术构建了由ＣａＭＶ３５Ｓ启动子

的植物表达载体，为进一步利用ＤＲＥＢ１Ａ基因综合改良植物抗逆性提供了物质基础。

１

材料与方法

１．１

材料

哥伦比亚生态型拟南芥幼苗。大肠杆菌菌株ＤＨ５α购自大

连宝生物工程有限公司；克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；

Ｇａｔｅｗａｙ载体ｐＤＯＮＲ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ｐＨ２ＧＷ７双元载体购

自ＶＩＢ公司。

Ｔａｑ酶、氨苄青霉素、壮观霉素、潮霉素、ＩＰＴＧ、Ｘ－ｇａｌ等购自大连宝生物工程有限公司；Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＥｃｏＲⅤ性内切酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＰｌａｔｉｎｕｍｐｆｘＤＮＡ聚合酶购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；逆转录酶ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ、ＤＮＡ回收试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；琼脂糖购自Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ公司；测序试剂购自Ａｍｅｒｓｈａｍ公司；其他各种试剂均为国产分析纯产品。

１．２拟南芥总ＲＮＡ的提取

将拟南芥离体幼苗置于放有润湿滤纸的培养皿上，４℃低温

处理２ｈ后，于冰上剪取叶片，采用ＣＴＡＢ法提取植物总ＲＮＡ（步骤略）。

１．３ＤＲＥＢ１Ａ基因的ＰＣＲ扩增

根据ＧｅｎＢａｎｋ中已经登录的拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ基因全长

ｍＲＮＡ序列，利用ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５．０软件分别在基因的ｍＲＮＡ

启始密码子上游和终止密码子下游设计长度约２５ｂｐ的引物。

上游引物：５′－ＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＴＣ－３′；下游引物：５′－ＴＴＴＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＴＧＡＡＧＡＴ－３′

。以总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ反应，条件为４２℃２０ｍｉｎ、９９℃

５ｍｉｎ。ＲＴ反应结束后，采用高保真的ＰｌａｔｉｎｕｍｐｆｘＤＮＡ聚合酶

进行基因全长的ＰＣＲ扩增，反应条件如下：９４℃预变性２ｍｉｎ；

９４℃变性１５ｓ，３９℃退火３０ｓ，６８℃延伸２ｍｉｎ，共３０个循环；

６８℃延伸７ｍｉｎ，４℃终止反应。

由于用ＰｌａｔｉｎｕｍｐｆｘＤＮＡ聚合酶扩增只能得到平滑末端产物，所以在ＰＣＲ反应体系中添加１Ｕ的Ｔａｑ聚合酶，７２℃孵育８ｍｉｎ，得到具有３＇－ｐｏｌｙ（Ａ）的产物。用琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，采用东洋纺（上海）生物科技有限公司的小量胶回收试剂盒纯化。

１．４ＤＲＥＢ１Ａ基因的克隆

将具有３＇－ｐｏｌｙ（Ａ）的扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体，然后

转化大肠杆菌菌株ＤＨ５α，在含有ＩＰＴＧ和Ｘ－ｇａｌ的ＬＢ／Ａｍｐ平板上筛选白色菌落提取质粒。对重组质粒经ＰＣＲ鉴定后用Ｔ７和

Ｓｐ６引物分别进行测序ＰＣＲ反应，纯化反应产物，测定核苷酸序

列，将测序结果在ＮＣＢＩ网站进行ＢＬＡＳＴ。

１．５克隆基因两侧引入ａｔｔＢ重组位点

根据Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术的要求设计Ｂ序列引物，用于扩增

带有Ｂ序列接头的全长ＤＲＥＢ１Ａ基因。鉴于Ｂ序列较长（ＧＧＧＧ＋２５ｂｐａｔｔＢ），故采用２次ＰＣＲ的方法在克隆基因的上下游各加入一段Ｂ序列。设计引物如下：

ａｔｔＢ１－ＤＲＥＢ１Ａ－Ｆ：５′－ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＴＣ－３′；ａｔｔＢ２－ＤＲＥＢ１Ａ－Ｒ：５′－ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＴ－３′

；ａｔｔＢ１－ａｄａｐｔｅｒ－Ｆ：５＇－ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ－３＇；ａｔｔＢ２－ａｄａｐｔｅｒ－Ｒ：５＇－ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ－３＇。

仍然采用ＰｌａｔｉｎｕｍｐｆｘＤＮＡ聚合酶，利用ａｔｔＢ－ＤＲＥＢ１Ａ上下游引物进行ＰＣＲ反应，在ＤＲＥＢ１Ａ全长基因的上下游加入一部分的Ｂ序列，反应条件如下：９４℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性１５

ｓ，７０℃退火３０ｓ，６８℃延伸２ｍｉｎ，共３０个循环；６８℃延伸７ｍｉｎ，４℃终止反应。然后以此ＰＣＲ产物为模板，利用ａｔｔＢ－ａｄａｐｔｅｒ

上下游引物进行第２次ＰＣＲ反应，反应条件如下：９４℃预变性２

ｍｉｎ；９４℃变性１５ｓ，６６℃退火３０ｓ，６８℃延伸２ｍｉｎ，共３０个循

环；６８℃延伸７ｍｉｎ，４℃终止反应。在ＰＣＲ反应体系中添加１Ｕ的Ｔａｑ聚合酶，７２℃孵育８ｍｉｎ，得到具有３＇－ｐｏｌｙ（Ａ）的产物。用琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，纯化回收。

１．６带有Ｂ序列接头的ＤＲＥＢ１Ａ全长基因的克隆

带有Ｂ序列接头的ＤＲＥＢ１Ａ全长基因的克隆方法与

ＤＲＥＢ１Ａ基因的克隆方法相同，见１．４。１．７

ＢＰ反应

ＢＰ反应的目的在于将含有ａｔｔＢ接头的ＰＣＲ产物克隆到含

有ａｔｔＰ的ｄｏｎｏｒ载体上以产生Ｅｎｔｒｙ克隆。以测序正确的ａｔｔＢ－

ＤＲＥＢ１Ａ质粒为模板，采用高保真的ＰｌａｔｉｎｕｍｐｆｘＤＮＡ聚合酶，

利用ａｔｔＢ－ａｄａｐｔｅｒ上下游引物进行ＰＣＲ反应，ＰＣＲ产物纯化后

图１Ｇａｔｅｗａｙ

克隆技术原理示意图

１．８ＢＰ反应产物的转化及阳性克隆的鉴定

将ＢＰ反应产物转化大肠杆菌菌株ＤＨ５α，然后提取质粒。用Ｍ１３正反向引物进行测序ＰＣＲ反应，纯化反应产物，测定核苷酸序列，以进一步确定阳性克隆。

１．９ＬＲ反应

ＬＲ反应的目的在于将已经重组入Ｅｎｔｒｙ载体的目标基因再克隆到表达载体ｐＨ２ＧＷ７，以产生表达克隆。ＬＲ反应体系中包括Ｅｎｔｒｙ克隆１００～３００ｎｇ、ｐＨ２ＧＷ７载体１μＬ、５×ＬＲＣｌｏｎａｓｅＴＭ反应缓冲液４μＬ、ＬＲＣｌｏｎａｓｅＴＭ酶混合物４μＬ，补充ＴＥ缓冲液（ｐＨ８．０）至２０μＬ。反应体系置２５℃温育１６ｈ后加入２μＬ蛋白酶Ｋ溶液，３７℃温育１０ｍｉｎ以终止ＬＲ反应。

１．１０ＬＲ反应产物的转化及阳性克隆的鉴定

将ＬＲ反应产物转化大肠杆菌菌株ＤＨ５α，提取质粒。对重组质粒进行ＰＣＲ和酶切鉴定，以确定阳性克隆。

２结果

２．１ＤＲＥＢ１Ａ基因的ＰＣＲ扩增

以拟南芥总ＲＮＡ为模板，采用ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ进行反转录。以反转录得到的ｃＤＮＡ第一条链为模板，采用高保真的ＰｌａｔｉｎｕｍｐｆｘＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ扩增，得到约８００ｂｐ左右的ＤＮＡ片段（图２），与ＧｅｎＢａｎｋ中报道的长度一致，且ＰＣＲ产物量满足回收纯化要求。

２．２ＤＲＥＢ１Ａ基因的克隆

ＰｌａｔｉｎｕｍｐｆｘＤＮＡ聚合酶具有３＇到５＇外切酶活性，能够消除错误碱基配对，降低错配率，而且热稳定性优良，但是不能自动在ＰＣＲ产物的３＇端加ｐｏｌｙ（Ａ）。在ＰＣＲ结束后的反应体系中加入Ｔａｑ聚合酶，７２℃孵育得到了具有３＇ｐｏｌｙ（Ａ）的产物，将其与具有ｐｏｌｙ（Ｔ）粘性末端的ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接，转化大肠杆菌菌株ＤＨ５α后，鉴定阳性克隆。对ｐＧＥＭ－Ｔ载体上的插入序列进行核苷酸序列测定，结果表明该片段长度为８１５ｂｐ，与ＧｅｎＢａｎｋ中报道的拟南芥序列的核苷酸同源性达１００％。

２．３克隆基因两侧引入ａｔｔＢ重组位点

Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术要求在克隆基因的上下游两端加入特定的Ｂ序列接头，这样才能保证含有ａｔｔＢ接头的ＤＲＥＢ１Ａ全长基因的ＰＣＲ产物克隆到含有ａｔｔＰ的ｄｏｎｏｒ载体上以产生Ｅｎｔｒｙ克隆。利用设计的２组ＰＣＲ引物，分别进行２次ＰＣＲ反应后，获得含有Ｂ序列的ＤＲＥＢ１Ａ全长基因ＰＣＲ产物（图３）。

２．４带有Ｂ序列接头的ＤＲＥＢ１Ａ全长基因的序列测定仍然利用Ｔ７和Ｓｐ６引物分别进行测序ＰＣＲ反应，对反应产物进行纯化后，在ＤＮＡ序列测定仪上进行序列测定，结果如图４，显示ＤＲＥＢ１Ａ全长基因两端已经加入了Ｂ序列接头，并且读码框正确，未发生移码现象。

２．５ＢＰ反应后阳性克隆的鉴定

ＢＰ克隆酶可以在含有ａｔｔＢ位点的ＰＣＲ产物和ｐＤＯＮＲ２２１载体的特定位点同时发生切割作用，将ｐＤＯＮＲ２２１载体上的ｃｃｄＢ位点切下，替换成ＤＲＥＢ１Ａ基因的ｃＤＮＡ片段，构建含有卡那霉素抗性位点的Ｅｎｔｒｙ克隆。将ＢＰ反应产物转化大肠杆菌菌株ＤＨ５α后，用卡那霉素进行初步筛选。ｐＤＯＮＲ２２１载体上含有Ｍ１３测序引物结合位点，所以可以使用Ｍ１３正反向测序引物完成测序ＰＣＲ反应。测序结果表明，ＤＲＥＢ１Ａ全长基因已经被插入ｐＤＯＮＲ２２１载体中。

２．６ＬＲ反应后阳性克隆的鉴定

ＬＲ克隆酶可以在Ｅｎｔｒｙ克隆和植物表达载体ｐＨ２ＧＷ７的特定位点同时发生切割作用，将Ｅｎｔｒｙ克隆上的ＤＲＥＢ１Ａ基因和植物表达载体ｐＨ２ＧＷ７上的ｃｃｄＢ基因切下，同时发生置换，将ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧＴＴＴＣＴＴＧＡＡＡＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＴＴＣＣＧＡＣＧＣＴＴＧＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＧＴＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣＴＣＧＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＧＡＧＡＡＡＣＴＣＣＧＧＴＡＡＧＴＧＧＧＴＴＴＧＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＴＧＧＣＴＣＧＧＡＡＣＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＣＣＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＡＡＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＴＣＡＡＣＴＴＧＣＧＣＴＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＴＴＧＧＣＧＴＴＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＧＴＧＡＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＧＡＡＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＡＴＡＴＧＣＡＣＧＡＴＧＡＧＧＣＧＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＴＴＧＴＴＧＧＣＴＡＡＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＴＣＣＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＴＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＴＣＧＴＴＡＴＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＣＧＡＴＡＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＴＮＣＡＴＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＡＡＴＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＣＣＣ

图４含Ｂ序列接头的ＤＲＥＢ１Ａ的核苷酸序列

图２ＰＣＲ扩增产物电泳图谱Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＣＲ产物

图３克隆基因ＤＲＥＢ１Ａ两侧引入ａｔｔＢ位点

Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１：ＤＲＥＢ１Ａ全长基因；

２：带有部分Ｂ序列的ＤＲＥＢ１Ａ；３：带有Ｂ序列的ＤＲＥＢ１Ａ

佟友丽等：转录因子ＤＲＥＢ１Ａ基因的克隆与Ｇａｔｅｗａｙ

克隆技术构建植物表达载体２０７生物技术通讯

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７

ＤＲＥＢ１Ａ基因转移到植物表达载体ｐＨ２ＧＷ７上，而ｃｃｄＢ基因又结合到ｐＤＯＮＲ２２１载体上，这样就构建了含有壮观霉素抗性标记、潮霉素植物选择标记以及ＣａＭＶ３５ｓ启动子的ＤＲＥＢ１Ａ基因的植物表达载体ｐＨ２ＧＷ７－ＤＲＥＢ１Ａ，图５为酶切鉴定图谱，图６为重组质粒图谱。构建的植物表达载体可以用于多种方式的遗传转化研究。

３讨论

目前，植物表达载体的构建大多采用传统的酶切和连接方法，操作复杂且克隆效率低，载体与宿主系统之间具有较强的依赖性。Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术是一种位点特异的ＤＮＡ重组技术，它整合了各种载体的技术平台，克服了传统的酶切和连接方法构建载体的种种缺陷，能够将基因高效地克隆到一个或多个与Ｇａｔｅ－ｗａｙ克隆技术兼容的载体系统中。与其他载体构建的方法相比，Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术具有明显优势，操作简单快捷，通用性强，克隆效率高于９０％，且能保持基因定位和阅读框架不发生改变。在中间载体和表达载体上含有ｃｃｄＢ基因，ｃｃｄＢ蛋白可阻挠大肠杆菌ＤＮＡ促旋酶的重新聚合，故携带有此基因的载体无法在大肠杆菌中繁殖，只有发生重组被目的基因片段替换掉后，才可以使宿主菌不受影响，这就大大减低了载体构建过程中的假阳性［６］。因此，与其他植物表达载体构建方法相比，Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术具有明显的优势。

ＤＲＥＢ转录因子在植物的抗逆反应中起着关键作用，它可以激活具有ＤＲＥ顺式作用元件的一系列抗逆功能基因的表达，如可激活ｒｄ２９Ａ、ｃｏｒ１５ａ、ｋｉｎ１等［７，８］。这些基因的表达产物在植物抗逆反应中发挥着不同的功能，从而使得植株的抗逆性提高。目前，已经发现ＤＲＥＢ转录因子的基因至少有１２种之多。由此可见，利用ＤＲＥＢ转录因子构建植物表达载体进行植物抗逆性的遗传改良前景极佳。

参考文献

［１］ＫｅｎｗａｒｄＫＤ，ＡｌｔｓｃｈｕｌｅｒＭ，ＨｉｌｄｅｂｒａｎｄＤ，ｅｔａｌ．Ａｃｃｕｍｕ－ｌａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅＩｆｉｓｈａｎｔｉｆｒｅｅｚｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｉｓｃｏｌｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１９９３，２３（２）：３７７

［２］ＸｕＤ，ＤｕａｎＸ，ＷａｎｇＢ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌａｔｅｅｍ－ｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ，ＨＶＡＩ，ｆｒｏｍｂａｒｌｅｙｃｏｎ－ｆｅｒｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｗａｔｅｒｄｅｆｉｃｉｔａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９９６，１１０（１）：２４９

［３］ＴｈｏｍａｓｈｏｗＭＦ．Ｓｏｗｈａｔ＇ｓｎｅｗｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｐｌａｎｔｃｏｌｄａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎkＬｏｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２５（１）：８９

［４］ＬｉｕＱ，ＫａｓｕｇａＭ，ＳａｋｕｍａＹ，ｅｔａｌ．Ｔｗｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃ－ｔｏｒｓ，ＤＲＥＢ１ａｎｄＤＲＥＢ２，ｗｉｔｈａｎＥＲＥＢＰ／ＡＰ２ＤＮＡｂｉｎｄ－ｉｎｇｄｏｍａｉｎｓｅｐａｒａｔｅｔｗｏｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈ－ｗａｙｓｉｎｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ１ｙ，ｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１９９８，１０（８）：１３９１

［５］ＬａｎｄｙＡ．Ｄｙｎａｍｉｃ，ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，ａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙａｓｐｅｃｔｓｏｆｌａｍｂｄａｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ，１９８９，５８：９１３

［６］ＢｅｒｎａｒｄＰ，ＣｏｕｔｕｒｉｅｒＭ．ＣｅｌｌｋｉｌｌｉｎｇｂｙｔｈｅＦｐｌａｓｍｉｄＣｃｄＢｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｏｌｖｅｓｐｏｉｓｏｎｉｎｇｏｆＤＮＡ－ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩＩｃｏｍ－ｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，１９９２，２２６（３）：７３５

［７］ＫａｓｕｇａＭ，ＬｉｕＱ，ＭｉｕｒａＳ，ｅｔａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｐｌａｎｔｄｒｏｕｇｈｔ，ｓａｌｔ，ａｎｄｆｒｅｅｚｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｂｙｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆａｓｉｎｇｌｅｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ［Ｊ］．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９，１７（３）：２８７

［８］ＷａｎｇＨ，ＤａｔｌａＲ，ＧｅｏｒｇｅｓＦ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｆｒｏｍｋｉｎ１ａｎｄｃｏｒ６．６，ｔｗｏｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｇｅｎｅｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＡＢＡｏｓｍｏｔｉｃｕｍａｎｄｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１９９５，２８（４）：６０５

图５ｐＨ２ＧＷ７－ＤＲＥＢ１Ａ的酶切图谱Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１：ＥｃｏＲⅤ酶切ｐＨ２ＧＷ７－ＤＲＥＢ１Ａ图６植物表达载体ｐＨ２ＧＷ７－ＤＲＥＢ１Ａ

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