蛋白质含量的测定(Folin—酚法)

实验名称：蛋白质含量的测定（Folin-酚法）   实验日期： 

班级： 学生姓名： 

研究背景与目的：蛋白质是生物最重要的基本组成成份之一, 蛋白质的定量分析方法的研究在国际上一直十分活跃，Folin-酚法是一种灵敏度极高，可快速测定蛋白质含量的方法，广泛地应用于蛋白质含量的测定。

本实验培养掌握使用Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和操作方法，同时熟练722分光光度计的使用和比色法。

实验原理：Folin-试剂是由两部分组成，甲试剂相当于双缩脲试剂，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜离子结合生成络合物。试剂乙是磷钨酸和磷钼酸的混合液，在碱性条件下极不稳定，易被蛋白质和试剂甲生成的络合物还原，生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应。

根据此试剂与蛋白质的反应以及一定条件下，兰色深度与蛋白的量成正比，可用比色法，使用分光光度计，通过对呈现蓝色的混合物进行浓度测定，再依据比例计算出蛋白质含量。

仪器与试剂：722分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）

 架盘天平

 具塞刻度试管8支    15ml

 移液器 和1ml-5ml

 容量瓶              50ml*1

 小烧杯  漏斗 研钵

Folin酚试剂：试剂甲  试剂乙  

250ug/ml牛血清白蛋白标准原液  

材料：绿豆芽下胚轴

实验步骤：

1．标准曲线的绘制

取6支15ml具塞刻度试管，编号。如下表所列加入相应试剂。

2．样品测定

（1）称取绿豆芽下胚轴1g于研钵中，匀浆。转入50ml容量瓶中，定容。然后过滤，滤液即为样品液。

（2）取具塞刻度试管2支，编号8、9，分别加入滤液1ml，分别加入试剂甲5ml，混匀后放置10分钟，然后各加入试剂乙0.5ml，迅速混匀，室温下放置半小时，于650nm波长下比色，记录消光值，取其平均值完成计算。

数据整理与计算：

Folin-酚法测蛋白质含量的标准曲线

图1

从标准曲线中查得样品的OD650平均值对应的蛋白质含量X（ug/ml）=71ug/ml，然后按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。

样品中蛋白质含量（%）=X(ug/ml)*样品总体积（ml）*100

 样品重（g）*106

将数据X（ug/ml）=71ug/ml代入公式

样品中蛋白质含量（%）=71*50*100/(1*106)=0.355%

结果分析：经过本实验的数据计算，得到绿豆芽中蛋白质含量为0.355%，而网络上查得的绿豆芽中蛋白质含量为2.2%，与实验测得相差一个数量级，但是与其他实验组的同学讨论得知，所测得的含量都与我组所测的数量级相同。分析可知，豆芽的品种不同，生长所需要的条件和时间也不尽相同，所以与网络查得的数据比较价值很小，而与其他组比较可知我组数据相对准确。

参考文献：http://wenku.baidu.com/view/e4ec35360b4c2e3f572763f6.html 《蛋白质含量的测定》

  http://sky.scnu.edu.cn/life/class/biochemistry/Experimentation/Ex08.doc 《Folin—酚法测定血清蛋白质含量》

 http://wenku.baidu.com/view/499547a6f524ccbff1218488.html《蛋白质含量测定——福林酚法》

 http://hezi0321.blog.163.com/blog/static/2041113420100209343510/《Folin—酚试剂法（Lowry法）》

思考题：

1．为什么要求加入试剂乙后立即混匀？否则将会如何影响测定结果？

已知试剂乙未磷钨酸和磷钼酸混合液，乙试剂在酸性条件下较稳定，在碱性条件下极不稳定。又知Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液，所以加入试剂乙后要立即混匀，以便在在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前，使还原反应发生。否则试剂乙含量减少，使得蛋白质与试剂甲作用后的溶液不能完全反应，以致所测蛋白质含量偏低。

2．试分析本实验方法中的干扰因素

本实验方法中从物质角度分析蛋白质中氨基酸的R基团中的酚类物质，豆芽中的柠檬酸、甘氨酸、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。从实验过程分析，反应的操作时间不易控制，如：加入试剂乙后迅速混匀等。

3．为什么测定同一类甚至同一种物质的含量会有多种测定方法？

每一种测量方法都有各自的特点，即各有各的优缺点，如：Bradford法和Lowry法灵敏度最高，定氮法更准确，但也更加复杂。因为某一种并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质含量测定，于是，我们在选择测量方法时，要考虑实验对测定所要求的灵敏度和精确度，蛋白质性质，溶液中存在的干扰因素，测定所要花费的时间等等方面。所以会有多种测定方法。

4．在Folin-酚法中，试剂甲的作用是什么？

试剂甲的作用是与蛋白质中的肽键形成络合物，使其可以还原磷钨酸和磷钼酸，另外试剂甲可以为试剂乙的反应提供一个碱性环境。

实验小结：

在这一次的实验中，我与同伴的配合更加默契。在预习本实验时，我对此次实验操作所预测的时间为80分钟，但是实际操作中，实际用时为100分钟，预测不是十分准确，其中的原因也是我们的操作不熟练。另外，此次的实验不仅仅在锻炼我的操作能力，也让我对蛋白质的测量方法有了深刻的了解，查阅了多种测量方法，加深了对蛋白质的学习。