凝胶层析的研究及其应用

摘要：本文综述了凝胶层析的原理及其相关的参数和类型，以及在实际操作过程中的注意事项。并讲述了凝胶层析的一般应用。

关键词：凝胶层析 原理 注意事项 应用

层析法又叫色谱法   

色谱法从二十世纪初发明以来，经历了整整一个世纪的发展到今天已经成为最重要的分离分析科学，广泛地应用于许多领域，如石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境保护，乃至空间探索等。 将一滴含有混合色素的溶液滴在一块布或一片纸上，随着溶液的展开可以观察到一个个同心圆环出现，这种层析现象虽然古人就已有初步认识并有一些简单的应用，但真正首先认识到这种层析现象在分离分析方面具有重大价值的是植物学家Tswett。 Tswett关于色谱分离方法的研究始于1901年，两年后他发表了他的研究成果"一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用，提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。三年后，他将这种方法命名为色谱法（Chromatography），很显然色谱法 （Chromatography）这个词是由颜色（chrom）和图谱(graph)这两个词根组成的，派生词有chromatograph（色谱仪），chromatogram（色谱图），chromatographer（色谱工作者）等。由于Tswett的开创性工作，因此人们尊称他为"色谱学之父"，而以他的名字命名的Tswett奖也成为了色谱界的最高荣誉奖。 色谱法发明后的最初二三十年发展非常缓慢。液-固色谱的进一步发展有赖于瑞典科学家Tiselius（1948年Nobel Chemistry Prize获得者）和Claesson的努力，他们创立了液相色谱的迎头法和顶替法。分配色谱是由著名的英国科学家Martin和    

色谱图

Synge创立的，他们因此而获得1952年的诺贝尔化学奖。1941年，Martin和Synge采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，他们在这一工作的论文中预言了用气体代替液体作为流动相来分离各类化合物的可能性。 1951年，Martin和James报道了用自动滴定仪作检测器分析脂肪酸，创立了气-液色谱法；1958年，Golay首先提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法，发明了玻璃毛细管拉制机，从此气相色谱法超过最先发明的液相色谱法而迅速发展起来，今天常用的气相色谱检测器也几乎是在五十年代发展起来的。七十年代发明了石英毛细管柱和固定液的交联技术。随着电子技术和计算机技术的发展气相色谱仪器也在不断发展完善中，到现在最先进的气相色谱仪已实现了全自动化和计算机控制，并可通过网络实现远程诊断和控制。

凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。19年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。

1、凝胶层析原理

凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

2、凝胶层析相关系数

2.1 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积

   外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。

 2.2分配系数

    分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。

2.3排阻极限

    排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。

 2.4分级分离范围

    分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。

 2.5 吸水率和床体积

    吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。

 2.6 凝胶颗粒大小

    层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（m）来表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般比较常用的是100－200目。

3、凝胶的类型

凝胶的种类很多，常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶（dextran）、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）、琼脂糖凝胶（agarose）以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。

3.1 葡聚糖凝胶

  葡聚糖凝胶是指由天然高分子－葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex和Sephacryl。

  葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex  G-200，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是ml / g干胶）乘以10。如Sephadex的主要型号是G-10  105。Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex稳定工作的pH一般为为2－10。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。Sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。Sephadex的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex中排阻极限最大的G-200为6 C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephadex有各种颗粒大小（一般有粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。

 3.2. 聚丙烯酰胺凝胶

  聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（acrylamide）与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad  Bio-GelLaboratories生产，商品名为Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2  P-300等10种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的10-3，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。各种型号的主要参数如附表所示。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel 105。聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在pH为1~10之间比较稳定。但在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，所以吸附效应较小。另外，聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸附作用，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。

3.3.琼脂糖凝胶

  琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脱水半乳糖（anhydrogalactose）交替构成的多糖链。它在100 C时呈液态，当温度降至45 C以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有Pharmacia  4B）和Bio-Rad Laboratories生产的Bio-gelBiotech生产的Sepharose（2B  A等。关于各种琼脂糖凝胶的基本参数如附表所示。琼脂糖凝胶在pH为4－9之间是稳定的，它在室温下很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。另外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快。琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以0－30 C为宜。

 3.4聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶

  这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。它们主要由LKB提供，商品名为Ultragel。这种凝胶由于含有聚丙烯酰胺，所以有较高分辨率；而它又含有琼脂糖，这使得它又有较高的机械稳定性，可以使用较高的洗脱速度。调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使Ultragel有不同的分离范围，

 3.5多孔硅胶、多孔玻璃珠

  104塔板多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于无机凝胶。顾名思义，它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。这类凝胶属于硬质无机凝胶，它们的最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好，使用方便而且寿命长，无机胶一般柱效较低，但用微粒的多孔硅胶制成的HPLC柱也可以有很高的柱效，可以达到4 / 106。它们的最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理和选择洗脱液来降低吸附。另外它们也不能用于强碱性溶液，一般使用时pH应小于8.5。103－9106，多孔玻璃珠一般为3米。多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，所以柱效相对较低。多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽，多孔硅胶一般为102－5。

4、实际操作时注意事项

4.1装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀。

4.2凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。

4.3样品的浓度和加样量的多少。是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%-2%，制备用量一般为柱床体积的20%-30%。

5、凝胶的应用

5.1生物大分子的纯化

    凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶层析无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。

 5.2分子量测定

    前面已经介绍了，在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。

  Kav＝－b lg MW＋c

  Ve＝－b’ lg MW＋c’

    由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶层析测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大；上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶层析不能用于测定这类分子的分子量；另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶层析测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小；还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶层析的线性范围之内。

 5.3脱盐及去除小分子杂质

    利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。

 5.4去热源物质

    热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的方法。

 5.5溶液的浓缩

    利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。 

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