糖尿病发生发展的分子机制研究项目申报

二、预期目标

总体目标：

阐明中国人中与2型糖尿病发生发展相关的易感基因以及表观遗传因素；发现与2型糖尿病密切相关的主要营养素失衡及其作用机制，发现遗传因素与环境因素的交互作用对疾病的影响；确定2型糖尿病发生发展过程中内质网应激、氧化应激等细胞应激导致胰岛β细胞功能障碍、胰岛素抵抗的机制；揭示细胞应激在2型糖尿病发展过程中导致糖尿病肾病和心血管疾病的分子机制。获得一批原创性的科研成果，揭示新的2 型糖尿病干预和防治靶点。在糖尿病研究领域，培养一支临床和基础紧密结合、适应“转化型研究”要求的高级复合型人才队伍。

五年预期目标：

1.发现与中国人2型糖尿病发生发展相关的易感基因和表观遗传变化；阐明细胞应激关键因子基因变异与2型糖尿病发生发展的关系；阐明遗传因素和环境因素的相互作用机制；为遗传因素和环境因素用于2型糖尿病及其并发症的风险评估提供理论依据；

2.发现与我国2型糖尿病密切相关的主要营养因素；发现2型糖尿病易感位点与营养因素相互作用在2型糖尿病发生发展中的作用；明确营养失衡与细胞应激在糖尿病中的分子机制；提出新的营养相关糖尿病危险因子和病因假说及预防和干预靶点；为建立适合中国汉族人群遗传背景和膳食特点的2型糖尿病营养干预策略提供理论依据；

3.结合遗传和环境因素，初步探讨中国2型糖尿病患者胰岛β细胞发生内质网应激的独特机制；阐明脂肪酸通过FoxO1诱导胰岛β细胞内质网应激的机制；寻找新的内质网应激标志分子；提供新2型糖尿病防治靶点、筛选新靶点药物；

4.探讨脂肪、肝细胞因子的分泌及其在肝细胞应激、肝脏胰岛素抵抗及2型糖尿病中的病理作用；开发相关试剂盒；为脂肪因子及肝细胞因子用于2型糖尿病发生发展的早期风险评估提供理论基础及临床依据；建立基于脂肪/肝脏细胞因子和脂肪-肝脏中轴的新药开发平台，为靶分子作为药物开发提供理论基础；

5.从线粒体能量代谢角度，探讨UCP2介导糖尿病肾病足细胞损伤的分子机制；从细胞自身稳态调节和异常转分化的角度，探讨足细胞在高糖环境下由氧化应激和内质网应激介导的蛋白尿和肾小球硬化的分子机制，寻找减少足细胞凋亡、蛋白尿的新方法。探讨氧化损伤白蛋白诱导血管细胞的应激和损伤，促进加速性动脉粥样硬化的发生和发展的分子机制，寻找新的致病分子、致病环节，探索新的干预途径；

6.阐明与2型糖尿病大血管病变直接相关的内皮细胞和平滑肌细胞代谢和氧化应激变化图谱；获得血液或尿液中可用于糖尿病心血管并发症早期诊断和病情监测的特异性分子标记物，筛选出存在于糖尿病病人呼吸气体中代谢相关分子标记；为将GLP-1用于糖尿病心血管病并发症的防治提供基础和临床研究资料。

7.建立一支临床和基础紧密结合的多学科交叉的 2型糖尿病研究梯队，并实现从实验室到临床（bench to bedside）的完整对接；

8.在国际学术期刊上发表 100篇以上学术论文，并在Cell、Nature、Science 等国际一流杂志上发表若干篇论文。申请15－20项国内外发明专利。开发相关试剂盒，用于2型糖尿病发生发展的早期监测和早期防治。

三、研究方案

总体研究思路：

本项目的总体研究思路由两个部分组成：第一部分主要是研究2型糖尿病发生发展中的遗传因素与环境因素，以及二者间的相互作用。这部分的研究技术路线包括：利用已有的大规模横断面和随访5-13年社区样本、2型糖尿病患者样本、2型糖尿病家系样本，结合已有的糖脂代谢及并发症检测中的金标准指标、以及体力活动、饮食习惯等信息，采用全基因组范围外显子组深度测序、高通量SNP检测等技术，运用大样本病例－对照关联分析、家系关联分析等分析手段，发现与2型糖尿病发生发展密切相关的遗传因素，并通过遗传流行病学和表观遗传学的分析和研究，阐明遗传和环境因素在2型糖尿病发生发展中的相互作用。同时在中国人群中分析脂肪酸种类和比例、重要维生素、主要矿物元素等营养因素与2型糖尿病的关系，及其与遗传因素的交互作用。第二部分是以内质网应激和氧化应激等细胞应激为研究切入点，采用基因敲除、转基因、RNA干扰以及其他分子生物学技术，利用代谢组、蛋白质组学等系统生物学研究手段，并结合葡萄糖钳夹等糖代谢病理生理评价金标准，在分子、细胞、整体动物和人体组织等层面，研究2 型糖尿病发生发展过程中胰岛β细胞受损、肝脏胰岛素抵抗的分子机制；同时还要研究2型糖尿病发展过程中肾脏和心血管病变的关键分子和作用机制。在围绕细胞应激开展糖尿病及主要并发症的分子机制研究的同时，将注意重要指标的量化和标准化。

技术路线：

1.2型糖尿病发生发展中遗传因素的发现及其作用机制研究：

1)2型糖尿病及并发症的易感基因研究：在前期获得的2型糖尿病全外显子组范围深度测序信息的基础上，针对新发现的潜在的2型糖尿病易感基因开展大样本关联研究。同时，以本项目其他课题组新发现的与细胞应激关键因子为研究对象，分析基因变异与糖尿病发生、发展的关系。应用时间飞行质谱生物芯片技术，开展大样本、高密度SNP基因型检测。从样本库中选取横断面病例-对照人群（N＝~7,000）以及家系样本（N＝~3,000），研究SNP与2型糖尿病及其并发症的相关性，在大样本北方人群和5年随访的前瞻人群进一步验证，确认影响2型糖尿病发病和糖尿病并发症的易感基因，研究遗传因素与环境因素（体力活动、饮食习惯等）的相互作用在糖尿病发生、发展中的作用。

2)易感基因的功能研究：我们将进一步对已经发现的基因变异开展功能研究。通过生物信息学分析基因变异的出现位点、发生频率、SNP多态性类型以及与下游表达蛋白之间的关系；通过结构生物学和分子生物学手段构建变异基因发挥功能的生物大分子，解析其与野生型功能分子之间的差异，从分子水平获得基因变异所致的功能分子缺陷；最后使用蛋白质组学方法分析野生型和变异基因所导致的体内表达谱的整体变化，建立易感基因与疾病发生关联的完整模型。

3)开展糖尿病表观遗传学研究：从已建立的糖尿病和正常血糖者组织库中选取年龄、性别，肥胖程度、生活方式等因素匹配的糖尿病患者和正常血糖者的骨骼肌、脂肪或肝脏组织标本。提取组织的基因组DNA，采用MedIP或MAP的方法对甲基化DNA区域进行富集，运用深度测序方法获得两组间存在差异的甲基化区域信息。在此基础上采用BSP或MSP技术，扩大样本验证前期结果。分析重要靶组织中甲基化差异与基因表达水平的关系，以及这些差异与2型糖尿病发病的关系。

4)开展糖尿病与肝癌的机制研究：从肝癌组织库中选取伴有和不伴有糖尿病的肝癌患者肿瘤及癌旁组织标本，应用SPSS统计分析肝癌患者的预后与糖尿病的关系；通过免疫组化方法在组织芯片上检测肝癌患者肿瘤微环境中FOXP3，CD68，IL，Th1,Th2和Th17等因子表达水平的改变与糖尿病发生的关系，明确糖尿病在肝癌进展过程中的作用；应用基因芯片进行基因组学研究，筛选伴有糖尿病的肝癌患者的肿瘤及癌旁组织中与肝癌患者术后转移复发相关的关键基因，并在大样本人群中进行验证，应用生物信息学手段建立分子网络，以阐明糖尿病影响肝癌发生和发展的分子机制。通过脂质受体分析，筛选糖尿病引发的与肝癌相关脂质受体，并进行功能研究，阐明糖尿病-脂质受体-肝癌三者之间的关系。

5)研究端粒与糖尿病的关系：在3,000例2型糖尿病与3000例对照样品中进行定量PCR，采用RNase P这一2拷贝基因作为内参，使用端粒特异性引物扩增曲线Ct值与RNase P扩增曲线的Ct值的比值（T/S ratio）衡量每一个体的端粒长度。使用回归方程对个体的端粒长度与糖尿病发病之间的相关性进行分析，在分析中校正年龄，BMI，性别，吸烟状况等对端粒有影响的因素。在糖尿病病例中，计算患病时间对端粒缩短速度的影响，同时，分析一些与2型糖尿病密切相关的炎性指标（如CRP等）与端粒长度的之间的关系。 此外，将通过3次随访，进一步研究端粒与血糖转归的关系。

2.营养因素与2 型糖尿病的关系及作用机制研究：

1)营养、遗传因素与2型糖尿病的人群和相关机理研究：

●脂肪酸与2型糖尿病的流行病学研究：运用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测对3210位参加基线研究的京沪城乡居民的红细胞膜的饱和、单不饱和、多不饱（n-3,n-6）、以及反式脂肪酸组成和比例，并结合基线和追踪研究收集到膳食（24小时膳食回顾和过去1年的食物频度问卷）和体力活动等数据，以及空腹血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、HOMA-S、HOMA-B，总胆固醇，LDL和HDL胆固醇，甘油三脂，以及各种细胞因子（脂联素、视黄醇结合蛋白-4，抵抗素、C反应蛋白和IL-6）等数据，系统地研究脂肪酸的种类、数量和比例与炎性反应和2型糖尿病发生发展的关系，以及膳食结构尤其是脂肪摄入与红细胞膜脂肪酸种类和比例的关系。

●维生素与2型糖尿病的流行病学研究：运用酶联免疫吸附法、HPLC-电化学检测方法和放射免疫分析分别检测红细胞膜B族维生素，以及血液同型半胱氨酸和25-羟基维生D的浓度。并结合基线和追踪研究收集到膳食数据、上述糖脂代谢指标、以及细胞因子数据，动态地研究营养状况变化对2型糖尿病发病风险的影响。

●矿物元素与胰岛素抵抗、2型糖尿病的人群和相关的机理研究：采用ICP-MS测定钙、镁、铁、锌、硒、铬，并结合上述膳食数据和血糖、血脂、细胞因子、以及血浆铁蛋白水平，25-羟基维生素D等数据，系统地研究主要矿物元素对2型糖尿病发病风险的影响，并以铁代谢紊乱为表型的基因敲除小鼠为模型，通过膳食诱导探讨铁失衡与糖尿病发生的分子机制。

●遗传关联分析和基因-营养相互作用研究：从HapMap下载中国汉族人群的PPARG、PPARD、GC、GYP27B1、CYP24A1、CDR、TMPRSS6和HFE基因的所有SNP位点的基因型数据，选取标签SNP；采用TaqMan SNP基因分型系统，在3,210普通汉族人群样本中对上述SNP位点进行基因型分析，找出若干种中国汉族人群内与2型糖尿病及其相关表现型有关联关系的基因易感位点及其单倍型；分析PPARG和PPARD基因的变异与红细胞膜脂肪酸的相互作用对2型糖尿病及其相关性状的影响；分析GC、GYP27B1、CYP24A1和CDR基因的变异与维生素D的相互作用对2型糖尿病及其相关性状的影响；分析TMPRSS6和HFE基因的变异与铁蛋白的相互作用对2型糖尿病及其相关性状的影响。

2)血脂、炎性细胞因子与胰淀素表达及2型糖尿病的发生：

●利用小鼠胰岛β细胞株MIN6、原代培养的小鼠胰岛细胞通过Real-time PCR 和Western blot研究炎性细胞因子（TNF-α、MCP-1）对胰淀素表达的调节作用，并进一步利用生化与分子生物学手段探讨TNF-α和MCP-1发挥调节作用的分子机制。

●在肥胖症和胰岛素抵抗人群及对照人群（各500例）测定血压、体质指数、血糖、血脂、血浆炎性细胞因子、脂肪细胞因子及胰淀素水平，研究血脂水平、血浆炎性因子水平与胰淀素水平的关系，以验证体外实验的结果。探讨血浆胰淀素升高与代谢综合征、胰岛素抵抗和2型糖尿病发病的相关关系。

3)高危人群的营养干预研究：采用随机化对照，平行试验设计方案，将招募到的300名患有代谢综合征的志愿者，随机分为：（1）对照组：给予不含干预食物的点心（碳水化合物：脂肪：蛋白质=55：30：15）；（2）亚麻子干预组：每天食用含有30克亚麻子的面包；（3）核桃干预组：每天食用含有30克核桃的面包。同时，根据美国心脏联合会（AHA）推荐的方法对所有志愿者进行膳食和生活方式指导。收集干预前后的膳食，体力活动、用药情况和体格检查数据，以及血样和尿样。测定空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白等常规指标。并采用ELISA方法测定胰岛素、炎性因子、细胞因子、氧化应激水平指标及内皮细胞功能指标等。

3.内质网应激导致胰岛β细胞凋亡的作用机制研究：

1)制备内质网应激细胞模型，选择内质网应激小鼠模型：在小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞和ob/ob或者db/db小鼠原代胰岛细胞中加入脂肪酸或者衣霉素，通过检测内质网应激标志分子CHOP的转录和表达水平，选择脂肪酸或者衣霉素的处理浓度和时间，并确定本课题选用的糖尿病模型小鼠的周龄。

2)验证ChIP-DSL的结果：针对部分发生2倍以上变化的靶基因，设计引物，通过在小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞中加入脂肪酸，刺激一定时间后，用FoxO1抗体做染色质免疫共沉淀（ChIP）实验，初步验证芯片结果的可靠性。

3)构建启动子萤光素酶报告质粒，进一步验证这些基因是否受FoxO1，以及受的程度和方式：将挑选基因启动子克隆至pGL3-basic质粒；转染MIN6细胞，经脂肪酸处理，分析这些基因的启动子的活性变化；干扰FoxO1表达，观察这些启动子在脂肪酸处理后的活性变化是否被逆转；将FoxO1的持续失活突变体（DN-FoxO1）或者持续激活突变体（ADA-FoxO1）与启动子报告质粒共转染MIN6细胞，确定FoxO1对这些基因的程度；

4)采用定量RT-PCR及Western Blot的方法，进一步明确哪些基因被FoxO1：在小鼠胰岛β细胞系Min6细胞中加入脂肪酸处理，明确候选基因mRNA转录及蛋白质表达水平的变化；通过干扰FoxO1表达和过表达DN-FoxO1和ADA-FoxO1，分析候选基因在转录水平被的情况；分离2型糖尿病模型小鼠（ob/ob或db/db小鼠）的原代胰岛，比较糖尿病模型小鼠与其同背景对照鼠之间这些基因的表达差异，在体验证内质网应激肥胖模型小鼠内FoxO1靶基因的变化。采用免疫荧光技术，观察在脂肪酸刺激下MIN6内这些候选基因的表达量及在细胞内定位改变，合并内质网染色，观察这些基因在脂肪酸处理后与内质网共定位的可能性。

5)借助于过表达和RNA干扰的方法，了解候选基因对胰岛β细胞功能和数量的影响：构建候选基因的过表达和干扰腺病毒载体，感染MIN6细胞，观察这些基因表达的增加或缺失对MIN6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能以及对细胞数量的影响；过表达或者RNA干扰候选基因表达后，加入脂肪酸处理一段时间，从胰岛β细胞功能以及细胞活力两方面评估候选基因的功能，希望找到数个在脂肪酸诱导的内质网应激性胰岛β细胞损伤中发挥重要作用的基因。

6)制备其中意义较大基因的转基因及基因敲除小鼠：对于那些在胰岛β细胞系和原代分离胰岛上参与内质网应激细胞凋亡功能明确的基因，建立其β细胞特异性的转基因或基因敲除小鼠模型；构建成功的小鼠进行表型分析，研究这些基因对胰岛形成及胰岛素分泌功能的影响；观察胰岛大小及形态的变化，用Tunnel实验分析胰岛β细胞的凋亡情况，用免疫荧光技术对Ki67进行染色观察胰岛β细胞的增殖情况；分离转基因或基因敲除小鼠的胰岛，观察胰岛在脂肪酸刺激下的葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能（GSIS）以及细胞活力的变化，从而了解重要候选基因对离体胰岛功能的影响。

7)筛选药物靶点：针对上述功能明确的基因，运用药物筛选系统寻找选择合适的激动剂或抑制剂，初步探讨这些基因作为2型糖尿病防治靶点的可能性。

8)糖尿病模型大鼠实施胃绕道手术：选择发病的糖尿病模型大鼠实施胃绕道手术，动态监控胃绕道手术组与假手术组的血糖、血胰岛素及血脂等各项代谢指标；制备胰腺切片，HE染色观察胰岛形态及大小，免疫荧光实验分析Ki67增殖指标的变化，胰岛素染色观察胰岛β细胞在胰岛中的比例，CHOP等内质网应激分子在胰岛β细胞中的表达水平及分布情况，Tunnel方法观察胰岛β细胞凋亡率；分离原代胰岛，体外进行GSIS实验，测定胰岛素含量，测定CHOP等内质网应激标志分子的mRNA和蛋白水平，分析PDX-1、NueroD、MafA、GCK等与胰岛素转录及分泌相关分子的表达。

9)尿酸诱导胰岛β细胞损伤：设计大样本人群研究，通过观察糖代谢、胰岛素分泌及胰岛素敏感性等指标，进一步阐明体内高尿酸与细胞损伤的相关关系；利用小鼠原代分离胰岛和β细胞系MIN6观察不同浓度和处理时间条件下，尿酸对β细胞生存周期、凋亡以及GSIS的影响。在现有实验结果的基础上，进一步揭示尿酸造成胰岛细胞内质网和氧化应激的特异性信号传导通路，以及各个相关因素的之间的相互关系；建立β细胞特异性尿酸受体过表达的小鼠模型，通过经腹腔或皮下注射外源性尿酸，在体观察高尿酸对胰岛细胞氧化应激、内质网应激的影响。同时还可以通过给予降尿酸药物别嘌呤醇等，观察在高尿酸血症的条件下其对胰岛细胞直接或间接的保护作用。

4.内质网应激在肝脏胰岛素抵抗中的作用：

1)研究A-FABP, lipocalin-2和adiponectin在肝细胞应激发生中的作用及其和非酒精性脂肪肝、肝脏胰岛素抵抗的关系：在已建立的lipocalin-2基因敲除、adiponectin基因敲除、A-FABP基因敲除小鼠基础上，构建双基因敲除小鼠，研究正常及诱导下脂肪肝和胰岛素抵抗的发生、炎症反应的激活、内质网应激状态。分析肝脏脂肪和肝脏胰岛素信号通路传导；采用NFκ-B、ATF6、IRE1、PREK、p-eLF2、XBP1特异剪切形式、GRP78、JNK等蛋白表达的定量及活性检测分析肝细胞炎症反应及内质网应激状态； 研究A-FABP和/或lipocalin-2在体内过表达与肝脏内质网应激、脂肪肝和肝脏胰岛素抵抗的关系，adiponectin过表达是否可防止上述病变的发生。利用脂肪、肝脏、特定神经细胞条件性基因敲除小鼠，研究特定基因（CPT-1A, APPL2，AMPK r2、GPR116、Ahi等）在脂肪、肝脏以及神经细胞中的缺失对脂肪及肝脏细胞因子分泌、能量代谢以及细胞应激相关信号通路的影响。检测A-FABP和lipocalin-2转基因兔和野生型兔及小鼠模型在脂质代谢及肝脏脂肪沉积过程方面的差异。在整体水平上，将利用上述动物模型的肝脏标本，探讨这几种脂肪因子的单基因或双基因缺失在正常及肥胖情况下对肝组织内质网应激反应，将以UPR反应蛋白GRP78的表达水平，PERK磷酸化，XBP1 mRNA水平及JNK激活程度进行判定。在细胞水平上，我们将从小鼠分离原代肝细胞，研究重组lipocalin-2，A-FABP 或/和adiponectin蛋白对内质网应激的直接影响，并研究其信号通路。

2)肝细胞因子adropin 、FGF21在脂肪及肝脏细胞功能、能量代谢和胰岛素敏感性方面的作用：对FGF21基因敲除小鼠、adropin基因敲除小鼠模型及其相应的野生型对照组小鼠在经过正常饮食以及高脂饮食喂养后，鉴定其代谢相关表型，包括糖代谢，脂代谢，脂肪组织功能（例如脂肪储存、分解，脂肪细胞因子合成分泌等），分析肝脏的损伤及内质网应激状态。通过葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验研究FGF21或adropin缺失对各个主要代谢组织（脂肪组织、肝脏、肌肉）胰岛素敏感性的影响。

3)评估脂肪及肝脏细胞因子作为非酒精性脂肪肝、肝脏胰岛素抵抗、糖尿病及其血管并发症的风险预测和早期诊断价值： 在课题1 建立的上海地区5年随访社区人群和地区13年随访人群中深入研究血清中脂肪细胞因子（A-FABP, lipocalin-2和adiponectin）以及肝脏细胞因子（FGF21和adropin）水平和肝脏病变发生的相关性，并比较上述脂肪细胞因子/肝脏细胞因子的检测值与常规的诊断指标(CRP, 糖化血红蛋白和胆固醇等)的关系，以此来判定这些脂肪及肝脏细胞因子是否可用于非酒精性脂肪肝、糖尿病以及心血管疾病的风险预测和早期诊断。并在前瞻人群中做进一步的预测验证，最终评估这些脂肪细胞因子/肝脏细胞因子是否适用于监测疾病的发展进程，将这些疾病的预防及治疗时间推前。

4)肝脏miR-29家族小RNA在肝脏细胞内质网应激和胰岛素抵抗发生中的作用：通过高脂饮食饲养正常C57Bl/6小鼠，或选择胰岛素抵抗小鼠模型（ob/ob；db/db），通过HOMA-IR分析并确认胰岛素抵抗状态后，利用PAGE/Northern Blot或Real-time PCR方法研究miR-29家族各成员在胰岛素抵抗状态下，在肝脏组织中的表达特征；利用Western Blot或Real-time PCR方法进一步确认可导致胰岛素抵抗的转录因子NF-κB及其靶基因的表达特征，分析其和肝脏内质网应激状态的关系。

5)中枢神经系统在肝脏内质网应激及胰岛素抵抗发生过程中的作用：利用Flox条件删除系统，在小鼠中枢特定脑区或神经元删除目的基因（CPT-1A, APPL2，AMPK r2、GPR116、Ahi等），之后检测肝脏胰岛素信号通路、内质网应激的激活状态及对应特定脑区的生理变化，阐述目的基因在中枢中对肝脏功能的作用。

6)建立基于脂肪/肝脏细胞因子和脂肪-肝脏中轴的新药开发平台：使用自行建立的高通量体外检测系统筛选可促进脂肪细胞合成adiponectin、或促进肝细胞合成FGF21或adropin的化学小分子。根据A-FABP的蛋白结构，设计并合成可特异性抑制A-FABP活性的新型小分子化合物。在饮食或遗传诱导的肥胖小鼠模型中研究其治疗效果，在高脂饮食诱导的转基因兔模型中进行验证。同时，在前述的基因敲除小鼠模型中评估这些化学先导物的特异性，探讨药物诱导adiponectin合成或通过化学或遗传学手段抑制A-FABP对肝脏内质网应激状态的影响，探讨其在治疗肥胖相关代谢性疾病中的可能性。

5.线粒体氧化应激介导糖尿病肾病的作用机制研究

1)观察STZ导致的糖尿病小鼠动物模型中，肾小球足细胞数目和足突的变化与UCP2蛋白表达变化的关系。利用已构建的UCP2基因缺失小鼠与配对的野生型小鼠建立STZ糖尿病动物模型，观察其足细胞数目和足突的变化，以及尿白蛋白和肾功能的变化，同时比较2种小鼠的差异，分析UCP2基因缺失对足细胞结构与功能的影响。应用RNA干扰技术抑制足细胞UCP2的表达，检验诱导UCP2表达是否是高糖引发足细胞损伤所必需。观察抑制UCP2蛋白的足细胞，在高糖作用下该细胞特定的重要结构蛋白，如Nephrin，WT-1等表达与分布的变化；同时，观察纤维连接蛋白和整合素联接激酶(ILK)表达与分布的变化，分析UCP2对足细胞结构与功能的影响，以及拮抗高糖作用的可能机制。

2)运用牛磺熊脱氧胆酸（TUDCA），从实验动物、细胞水平寻找减少细胞应激介导的足细胞凋亡、蛋白尿、细胞外基质（ECM）积聚，治疗糖尿病肾病的新方法。并使用TUDCA主动干预足细胞EMT，观察糖尿病肾病小鼠肾组织病理、尿蛋白、足细胞凋亡率、足细胞标记蛋白Nephrin，WT-1等、内质网应激指标GRP78、GRP94等、线粒体氧化应激指标谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和丙二醛(MDA)等，线粒体呼吸链复合物I、II，一氧化氮合成酶(NOS) ，细胞自噬标记蛋白LC3等、EMT标记物等的变化。同时体外培养小鼠肾脏足细胞，运用western-blotting、real-time PCR等方法，并通过流式细胞仪，观察AGEs、高糖、血管紧张素II、TGF-β是否导致线粒体氧化应激和内质网应激指标的异常变化，并监测足细胞凋亡率、LC3-II、α-SMA、E-cadherin、纤维连接蛋白、胶原I 蛋白的异常变化。同时使用TUDCA平行干预足细胞，观察细胞凋亡率、标记蛋白、EMT标记物等指标的变化。

3)以体外培养的人血管内皮细胞为对象，观察氧化损伤白蛋白对粘附分子表达、血管活性物质合成及氧化应激的影响；采用双室法研究其对血管内皮通透功能的影响并观察细胞骨架的变化。采用动脉粥样硬化动物模型观察氧化损伤白蛋白慢性负荷对血管内皮炎症反应及血管活性物质合成的作用，观察血管内皮细胞凋亡，动脉组织匀浆组织因子活性和表达，以及PAI-1和抗凝血因子（如Thrombomodulin）的表达。通过细胞和动物模型，研究氧化损伤白蛋白对血管平滑肌细胞细胞周期的变化（流式细胞仪法）和细胞增殖的改变（DNA定量）的影响，观察氧化损伤白蛋白对血管平滑肌细胞离子通道（钙通道，钾通道）的影响 （膜片钳法）及其与细胞内离子浓度和细胞功能的关系，研究氧化损伤白蛋白对动脉中层厚度和平滑肌细胞增殖的作用。研究循环单核细胞或体外诱导分化的巨噬细胞在氧化损伤白蛋白作用下，促炎症因子（ELISA法）生成、吞噬LDL（同位素标记法）、泡沫样变的程度和速率的变化。研究氧化损伤白蛋白对血管细胞和单核细胞作用的受体（RAGE、各类清道夫受体、和Toll-like receptor）途径，细胞氧化应激以及ROS主要来源（NADPH氧化酶活化），以及细胞信号传导途径（PKC-MARK-NF-κB）。观察氧化损伤白蛋白对血管细胞RAS各关键成分（ACE、AⅡ、AT1、AT2）表达的影响。通过阻断RAGE、NADPH氧化酶活化等方法，研究抑制氧化损伤白蛋白致血管损伤作用的方法及其对加速性动脉粥样硬化的干预作用。

6.氧化应激导致2型糖尿病大血管损伤的作用机制

1)分别以实验分离的正常大鼠和糖尿病模型大鼠的主动脉内皮细胞和血管平滑肌细胞为对象，观察它们在经由模拟糖尿病早期的慢性高血糖和高胰岛素刺激后所发生的增殖、迁移和凋亡等形态学改变；测定细胞中主要ROS浓度，检测线粒体功能和代谢变化；采用双向凝胶电泳结合质谱分析和生物信息学等开展蛋白质组学研究，通过气相色谱一质谱(GC/MS)对相关细胞开展代谢组学分析。综合上述结果，分析高血糖引起的代谢和氧化应激变化，鉴定出高血糖诱导的内皮细胞和平滑肌细胞中线粒体和胞浆产生ROS的主要途径和来源。采用质谱分析方法，检测这些细胞的外吐小体中的蛋白质水平在病变前后的变化。

2)选取2型糖尿病病人和伴发心血管并发症的人群为研究对象（每组50-60 人）。采用质谱分析法，比较这些人群呼吸气体中代谢相关有机成分的差异，重点观察异戊二烯胆固醇，丙酮和甲基（methyl nitrate）等在各组中的差异；采用蛋白质组学技术，比较分析其尿液标本组别间蛋白质谱的差异。

3)开展GLP-1用于糖尿病心血管病并发症防治的基础和临床研究，研究GLP-1对糖尿病动物模型（ob/ob）和ApoE（-/-）基因敲除动物的内皮细胞和平滑肌细胞的影响，体内实验测定活体动物心血管指数的改善情况，主动脉内皮细胞和平滑肌细胞病理改变，和相关的氧化应激分子表达的变化。采用RNA 干扰和小分子抑制剂判断GLP-1发挥作用的信号途径。在取得知情同意和通过医学伦理的基础上，开展GLP-1随机双盲临床研究。

在围绕细胞应激开展糖尿病及主要并发症的分子机制研究的同时，将注意重要指标的量化和标准化。将采用8-OHG/8-OHdG、SOD、ROS、4-HNE、MDA、蛋白羰基化、蛋白酪氨酸硝基化、AOPP、AGEs等指标分析DNA/RNA损伤、氧化/抗氧化应激系统、脂质过氧化、蛋白氧化等变化。通过分析PERK、CHOP、ATF4、BiP等指标了解内质网应激程度。

取得重大突破的可行性分析:

1. 临床样本资源及其优势：

1) 大而全的临床样本库：上海交通大学附属第六人民医院糖尿病研究所自1996年起，开展“上海糖尿病研究（Shanghai Diabetes Study）”“上海糖尿病并发症研究（Shanghai Diabetic Complication Study）”。已拥有最大的中国糖尿病家系库（N＝～7,000）、2 型糖尿病患者库（N＝～5,000）、社区人群库（N＝～10,000）。并已对上述人群建立DNA、血清、尿液等样本库和临床资料数据库。中日友好医院牵头完成了2008 年全国糖尿病流行病学调查。通过全国流调建立了北方病例－对照人群（N＝～10,000）。中科院上海生科院营养所2005 年完成了“中国老龄人口营养健康状况研究”基线研究现场调查（N＝～3,300），样本人群选自北京和上海的城乡，以此作为中国南北地区的代表。整个项目组的临床样本库总量超过35,000，可以保证有较高的统计学效力进行易感基因关联分析。

2) 大样本前瞻随访队列：上海交通大学附属第六人民医院、上海市糖尿病研究所在上海曹杨、华阳已建立5年随访队列（N＝～3,000）。大学已对基线无糖尿病的人群进行了13年追踪随访（N＝～600）。上述前瞻研究资料为研究和验证早期诊断与干预的标志物提供重要支持。

3) 具有详细的临床性状指标：上海交通大学附属第六人民医院、上海市糖尿病研究所的正常血糖对照组样本全部来自社区流行病学调查，临床指标包括：糖脂代谢指标（血糖、血脂、胰岛素、尿白蛋白/肌酐比等），体脂指标（身高、体重、腰围、臀围、体脂百分数等），其他生化指标（肝酶、肾功能等），血清脂肪因子水平，饮食习惯和生活方式，糖尿病家族史，其他疾病史（心血管疾病、血脂紊乱、肿瘤等）等情况。此外，糖尿病组来自住院患者，有详细用药情况（降糖、降脂、降压等用药详细情况）、并发症情况（大血管病变、微血管病变）、临床结局（发生心血管事件、肾功能衰竭等）等指标。这些为开展基于详细数量性状的分析提供很好的基础。部分人群具有胰岛素抵抗和胰岛素分泌金标准诊断资料（葡萄糖钳夹）、局部体脂分布精确诊断资料（磁共振检测腹部体脂分布）。中科院上海生科院营养所“中国老龄人口营养健康状况研究”的人群具有疾病史、生活方式、心理状况、膳食资料、人体测量学指标、糖脂代谢指标、各种炎性因子和脂肪细胞因子，以及铁蛋白、维生素D等营养元素数据。这些详细数据不仅可保证定性与定量分析需要，而且可以用于分析2型糖尿病发生发展过程中遗传因素与生活方式、营养元素之间在是否有交互作用。

4) 上海交通大学附属第六人民医院糖尿病研究所在取得医学伦理和知情同意的基础上，获得正常人、肥胖者、2型糖尿病者的肌肉、脂肪等组织样本，可用于进一步验证基础（细胞和动物）研究结果。

2. 在前期“973”项目资助下，已取得以下研究成果：

1) 在2型糖尿病流行病学和易感基因研究方面：上海交通大学附属第六人民医院完成了大范围社区和住院患者糖尿病及其并发症研究，并在此基础上完成所有国际上已报告的2型糖尿病易感基因研究工作，最近还发现1 个与中国人2 型糖尿病易感性相关的新基因。受NIH 资助，正在进行2 型糖尿病全外显子组深度测序工作。相关文章发表在Diabetes、Diabetologia 等糖尿病研究领域重要杂志上。参加本项目的中日友好医院牵头完成了2008 年全国糖尿病流行病学调查，相关论文在New Engl J Med 发表。

2) 营养因素与2型糖尿病的研究方面：中科院上海生科院营养所进行了肥胖、代谢综合征、2型糖尿病等慢性代谢性疾病的营养、遗传及危险因子分析。已在Circulation、Diabetes、Diabetes Care、AJCN 等国际心血管、糖尿病和营养科学领域的权威学术杂志发表研究论文30 多篇。曾多次被包括Nature Review Genetics、Cell、JAMA、New Engl J Med 等权威学术杂志论文引用。

3) 胰岛β细胞研究方面：南京医科大学、中科院上海生科院在胰岛β 细胞功能障碍和凋亡机制、2型糖尿病与胰岛损伤等方面有长期基础研究经验，在国内拥有最全的胰岛β 细胞系，成熟的胰岛分离技术及完善的生化和分子生物学技术平台。在β 细胞凋亡机制研究上，已在Diabetologia 等学术刊物上发表论文多篇。运用chIP-DSL 技术，已在小鼠胰岛β 细胞系中获得1个可能受FOXO1 直接的靶基因，为本项目的实施提供了前期工作基础。

4) 肝脏及脂肪因子与2型糖尿病、胰岛素抵抗的研究方面：中科院广州生物医药与健康研究院的研究团队发现并鉴定了一系列新脂肪细胞因子和肝脏细胞因子：该团队报道了adiponectin 具有防止脂肪肝的作用；开发了针对人的介导脂代谢紊乱的因子A-FABP的高度特异性检测试剂盒；发现lipocalin-2是介导肥胖相关的炎症反应和胰岛素抵抗的重要分子，并开发了第一个用于lipocalin-2检测的基于单克隆抗体的快速免疫检测方法；发现Angptl4 在维持糖脂代谢稳态上具有重要的作用；发现新肝脏细胞因子MUP1 具有增加胰岛素敏感性、促进能量代谢等作用。最近五年中，在JCI、Cell Metabolism、Circulation、Diabetes、PNAS、Gastroenterology、Hepatology、Diabetes Care、European Heart J 等杂志发表了70 多篇学术论文。该团队还获得了运用脂肪细胞因子作为肥胖引起的代谢疾病和心血管疾病的早期诊断和治疗靶点的三项国际专利。

5) 2型糖尿病肾病研究方面：南京医科大学、南方医科大学、中山大学的研究团队在肾功能不全的发生机理，尤其是小管－间质纤维化过程中上皮细胞转分化的机制研究上取得了很好的成绩；首次揭示了肾小管上皮细胞转分化的分子机理及其影响因素，并在蛋白质修饰在糖尿病慢性肾脏病发病的分子机制、肾功能不全的发病机制研究方面有良好的基础。还开展了肾脏疾病早期预警的生物学标记的系列研究。相关结果在New Engl J Med、JCI、JBC、Hepatology、Am J Pathol、JASN 等杂志上发表。

6) 2 型糖尿病心血管病变研究方面：南方医科大学和同济大学的研究团队在心血管发育、心肌细胞分化和再生治疗、心脏电生理失常的致病基因克隆、GLP-1 结构、功能和临床应用以及相关药物开发的研究等方面具有原创性工作基础。相关文章发表在Science、Nature、Nat Neurosci、Am J Hum Genet、Diabetes 等杂志上。

3. 实验材料与技术平台：

1) 本项目团队已拥有高水平的基因组、功能基因组、蛋白质组、代谢组、生物信息学等技术平台，可保证项目顺利实施。详细请见“工作基础部分”。

2) 已经构建和获得了lipocalin-2-/-、adiponectin-/-、FGF21-/-、HFE-/-、HJV-/-、Smad4-/-、Steap3-/-、UCP1-/-、UCP2-/-、UCP3-/-等基因敲除小鼠模型。

3) 建立了人体高葡萄糖钳夹试验（胰岛素分泌能力检测的金标准）、高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验（胰岛素敏感性检测的金标准）、磁共振波谱法测定人体肝脏脂肪含量（无创性肝脏脂肪含量精确检测技术）、磁共振检测腹内脂肪面积（腹内脂肪含量精确检测技术）等临床技术。

4) 建立了小鼠高葡萄糖钳夹试验、小鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验等技术平台。

创新点与特色：

1. 从临床提出问题，将基础研究与临床研究紧密结合，以临床防治为立足点，从中国人群的临床特点出发，以2 型糖尿病发生发展过程中关键组织器官损伤为研究核心，有望发现适合中国人群的防治关键，并促进基础研究成果迅速向临床转化。

2. 以细胞应激为研究分子机理的中心环节，研究重要组织器官损伤的分子机理，有望发现2 型糖尿病发生发展过程中的重要分子机制。

3. 充分利用大规模横断面人群、家系样本和前瞻人群，不仅能从“静态”角度准确观察遗传、营养、炎症因子等与2 型糖尿病发生发展的关系；而且能从“动态”角度验证“静态”研究的结果。

4. 将“组”学研究与金标准检测相结合，应用全外显子组深度测序、功能基因组学、代谢组学、蛋白质组学研究，从整体和宏观角度阐明2 型糖尿病发生发展的分子机制。同时结合葡萄糖钳夹技术（人体、小鼠）以及各种并发症、体脂分布的精确评价技术（人体），对疾病进程和变化进行精确定位，更准确的锚定关键分子与表型变化之间的相关性。

5. 开展多层次、全方位综合研究，以细胞、基因敲除小鼠、疾病动物模型、灵长类大动物为研究对象，揭示2 型糖尿病发生发展的关键分子机制；同时在取得医学伦理和知情同意的情况下在人体样本（组织、血液、尿液等）中进一步验证，使临床问题能得到解决和回答。

课题设置:

本项目设置6个课题：

课题1：2型糖尿病发生发展中遗传因素的发现及其功能研究

预期目标：发现与中国汉族人2型糖尿病发生发展相关的易感基因；阐明细胞应激关键因子遗传变异与2型糖尿病发生发展的关系；阐明2型糖尿病发病过程中遗传因素和环境因素的相互作用机制；为2型糖尿病及其并发症易感人群的早期发现提供理论依据。

主要研究内容：

1.基于全外显子组范围深度测序的2型糖尿病易感性关联研究：利用前期获得的中国人2型糖尿病全外显子组范围（外显子）深度测序信息，就发现的与2型糖尿病易感性潜在相关的变异位点开展大样本关联研究。在横断面病例-对照人群以及家系样本中，阐明基因变异与2型糖尿病发生和发展的关系，研究遗传因素与体力活动、饮食习惯等环境因素相互作用在糖尿病发生、发展（并发症）中的作用，并在北方人群中验证，同时在经5年随访的大样本社区人群中进一步验证易感基因对于糖代谢转归的预测作用。

2.细胞应激关键因子与2型糖尿病发生发展的遗传易感性研究：以最新报告以及本项目其他课题组新发现的细胞应激关键调节因子为研究对象，在横断面病例-对照人群、前瞻人群以及家系样本中分析基因变异与糖尿病发生、发展（糖尿病并发症）的关系。研究细胞应激关键因子遗传因素与体力活动、饮食习惯等环境因素在2型糖尿病发生、发展中的相互作用。

3.2型糖尿病易感位点、关键因子的功能研究：以1)、2)研究内容中新发现的基因变异为对象开展功能研究。分析变异基因与疾病的关系及其重要性，解析变异基因对应生物大分子的晶体结构，构建变异基因或对应蛋白的信息库，通过比较与野生型功能分子之间的差异，获得易感基因对应的功能分子缺陷，并研究其缺陷作用机制及下游体内表达谱的整体变化，建立易感基因与疾病发生的有效模型。另一方面，将利用已收集的人体高葡萄糖钳夹和高胰岛素－正葡萄糖钳夹的精确数据，分析2型糖尿病易感基因与糖尿病病理生理功能的关系。

4.表观遗传研究：在前期建立的糖尿病和正常血糖者组织库中选取年龄、性别、肥胖程度、生活方式等因素匹配的糖尿病患者和正常血糖者的重要靶组织（如骨骼肌、脂肪或肝脏）标本，在全基因组范围富集DNA甲基化区域，结合深度测序方法获得两组间差异的甲基化区域信息。并通过扩大样本验证前期结果，分析甲基化差异与基因表达水平的关系。

5.追踪国际上糖尿病基础研究领域的热点问题，研究2型糖尿病与肝癌的内在联系，开展端粒与糖尿病病程、炎症反应等指标的关联研究，为全面认识遗传因素与环境因素对于2型糖尿病的发生与发展的影响做出有力的补充。

经费比例：25.3% 

承担单位：上海交通大学、中日友好医院、复旦大学、北京大学人民医院

课题负责人：贾伟平 

学术骨干：项坤三、肖建中、樊嘉、周俭、刘赟、、纪立农

课题2：营养因素与2型糖尿病的关系及作用机制

预期目标：发现与2型糖尿病相关的主要膳食和遗传因素及其相关分子机制和潜在的干预靶点，为建立适合中国汉族人群遗传背景和膳食特点的2型糖尿病营养干预策略提供理论和实验依据。

主要研究内容：

1.营养、遗传因素与2型糖尿病发病风险的人群和相关机理研究：拟对“中国老龄人口营养健康状况研究”的人群（共3210位受试者）进行随访，并结合正在开展中国汉族人群2型糖尿病全基因关联研究和铁代谢动物模型，进行以下工作：

1)脂肪酸与2型糖尿病的关系和机理：明确中国京沪城乡居民的膳食结构，尤其是脂肪摄入，与红细胞膜脂肪酸种类（饱和，单不饱和，多不饱和脂肪酸，反式脂肪酸），脂肪酸比例（饱和/不饱和脂肪酸，单不饱和/多不饱和，3/6）的关系；发现脂肪酸与胰岛素抵抗和2型糖尿病发病的关系；探讨脂肪酸的种类和比例对炎性反应和脂肪细胞因子的影响；阐述基因易感位点与脂肪酸的相互作用对相关代谢表型和2型糖尿病发生发展的关系。

2)维生素、矿物元素与2型糖尿病的关系和机理：确定中国京沪城乡居民血液中B族维生素、25-羟基维生素D（25(OH)D）和钙、镁、铁、锌、硒、铬等微量元素的分布特征，以及与慢性炎症反应、胰岛素抵抗和2型糖尿病发生发展的关系；了解膳食结构和生活方式、遗传变异对维生素D、B族维生素、多种微量元素水平的影响和相关机理；并以代谢紊乱为表型的基因敲除小鼠为模型，探讨铁失衡与糖尿病发生的分子机制。

3)基因与营养相互作用对2型糖尿病的影响：通过对参与体内脂肪酸、维生素D和铁代谢的关键基因（PPARG、PPARD、GC、GYP27B1、CYP24A1、CDR、TMPRSS6和HFE等）进行遗传关联分析，发现在中国汉族人群内影响脂肪酸代谢、维生素D代谢和铁蛋白的转运、代谢和功能，进而影响2型糖尿病发病风险的基因多态性位点；探讨相关基因多态性与红细胞膜脂肪酸、血浆25-羟基维生素D和铁蛋白之间的相互作用对2型糖尿病及其相关性状的影响。

2.血脂、炎性细胞因子与胰淀素表达及2型糖尿病的发生：

1)在我们以前研究发现脂肪酸能上调2型糖尿病重要致病因子胰淀素表达的基础上，探讨炎性细胞因子（TNF-α，MCP-1）对胰岛β细胞胰淀素表达的调节作用及分子机制。

2)在肥胖症及胰岛素抵抗患者，探讨血脂、血浆炎性细胞因子水平与胰淀素水平的相关性，分析血浆胰淀素水平升高与代谢综合征、胰岛素抵抗和2型糖尿病的关联关系。

3.高危人群的营养干预研究：运用功能性食物亚麻子和核桃对300名2型糖尿病高危人群即罹患代谢综合征（NCEP-ATP-标准）个体进行为期3个月的随机膳食干预，通过比较干预前后的变化以及对照组与亚麻子或核桃干预组之间差异，确定亚麻子或核桃膳食干预对代谢综合征患病率以及血糖和血脂水平的改善作用。

经费比例：16.3% 

承担单位：中国科学院上海生命科学研究院 

课题负责人：乐颖影 

学术骨干：林旭、黎怀星、孙亮

课题3：内质网应激与胰岛β细胞凋亡

预期目标：初步探讨易感基因对内质网应激性胰岛β细胞凋亡的机制；揭示胃绕道手术治愈糖尿病的分子机制；探讨尿酸诱导胰岛β细胞损伤的分子机制；阐明脂肪酸通过FoxO1诱导胰岛β细胞内质网应激的机制；寻找新的内质网应激标志分子；提供新的2型糖尿病防治靶点并筛选新靶点药物。

主要研究内容：

1.结合遗传和环境因素，初步探讨中国2型糖尿病患者胰岛β细胞发生内质网应激的独特机制：以小鼠胰岛β细胞为模型，研究中国2型糖尿病患者具有独特的遗传易感基因（如NOS1AP等）在内质网应激状态下转录水平和表达水平的变化情况。在此基础上，通过RNA干扰或过表达的方法，确定这些基因在胰岛β细胞中的功能及其在内质网应激诱导胰岛β细胞凋亡过程中的作用。在环境因素方面，将通过动物模型和体外实验研究减肥手术（胃绕道手术）治愈糖尿病的机制，判断内质网应激主要信号传导通路中起最重要作用的通路；此外，将利用临床资料、体外细胞实验和高尿酸血症的动物模型研究高尿酸血症与2型糖尿病胰岛β细胞损伤的分子机制。

2.量化内质网应激的标志分子，研究FoxO1在脂肪酸诱导的内质网应激性胰岛β细胞凋亡中的作用机制：在获得脂肪酸刺激的针对FoxO1的启动子芯片（ChiP-DSL）结果的基础上，利用小鼠胰岛β细胞和2型糖尿病模型小鼠（ob/ob或者db/db小鼠）原代胰岛筛选出脂肪酸作用下受FoxO1而发生明显变化的基因。对这些变化明显的基因进行生物信息学分析，预测该基因作为内质网应激标志分子的可能性，推测其在正常胰岛β细胞以及在内质网应激时可能的作用方式。借助于分子生物学手段，分析这些基因与内质网应激的关系，以及对胰岛β细胞胰岛素分泌功能和细胞活力的影响，明确FoxO1的哪些基因参与了脂肪酸和内质网应激诱导的胰岛β细胞功能损伤和凋亡。

3.寻找FoxO1介导的新的内质网应激标志分子：借助糖尿病模型小鼠（ob/ob或者db/db小鼠）和胰岛β细胞系，确定上述基因在正常以及内质网应激时与内质网的共定位情况；分析高糖、高脂或者炎症因子作用下这些基因的改变水平与内质网应激损伤程度的对应关系。

4.PI3K/ AKT/FoxO1信号通路影响胰岛β细胞增殖的机制：借助糖尿病模型小鼠和胰岛β细胞系，观察在胰岛β细胞中PI3K/ AKT信号通路的活化对FoxO1靶基因的作用，进一步揭示PI3K/ AKT/FoxO1信号通路影响胰岛β细胞增殖的分子机制。

5.制备β细胞特异性的转基因或基因敲除小鼠模型，筛选糖尿病防治的新的靶点药物：基于上述研究结果，对于那些在胰岛β细胞系和原代分离胰岛上参与内质网应激细胞凋亡功能明确的基因，建立其β细胞特异性的转基因或基因敲除小鼠模型，进行表型分析，获得可能的新的糖尿病模型小鼠。针对上述功能明确的基因，运用药物筛选系统寻找选择合适的激动剂或抑制剂，初步探讨这些基因作为2型糖尿病防治靶点的可能性。

经费比例：14.7% 

承担单位：南京医科大学、中国科学院上海生命科学研究院 

课题负责人：韩晓 

学术骨干：苏东明、江秉华、周华荣

课题4：内质网应激与肝脏胰岛素抵抗

预期目标：探讨脂肪、肝细胞因子的分泌及其在肝细胞应激、肝脏胰岛素抵抗及2型糖尿病中的病理作用；开发相关试剂盒；为脂肪因子及肝细胞因子用于2型糖尿病发生发展的早期风险评估提供理论基础及临床依据；建立基于脂肪/肝脏细胞因子和脂肪-肝脏中轴的新药开发平台，为靶分子作为药物开发提供理论基础。

主要研究内容：

1.FABP, lipocalin-2和adiponectin在肝细胞应激发生中的作用及其和非酒精性脂肪肝、肝脏胰岛素抵抗的关系：利用已建立的各种基因敲除小鼠模型，对脂肪细胞因子（adiponectin，A-FABP和lipocalin-2）的分泌机制和其在肥胖引起的非酒精性脂肪肝和肝脏胰岛素抵抗的发生过程中的作用进行系统研究。检测常规和特定诱导下肝脏细胞内质网应激等分子标记的表达和脂肪肝的发生、炎症反应的激活之间的关系，研究A-FABP和/或lipocalin-2过量表达对肝脏细胞应激状态的影响，分析其在脂肪肝和肝脏胰岛素抵抗的作用，以及adiponectin过表达是否可以缓解内质网应激状态并防止上述病变的发生。拟构建并利用A-FABP和lipocalin-2转基因兔研究脂肪细胞因子在周身脂质动态维持及脂肪肝发生过程中的作用。在整体动物和细胞水平，探讨这几种脂肪细胞因子对肝脏细胞应激的影响，并研究其作用信号通路。对比小鼠及转基因兔模型疾病发生发展与人类疾病的相关性。 

2.肝细胞因子（FGF21和adropin）在肝脏及脂肪细胞功能和细胞应激状态、能量代谢和胰岛素敏感性的机制研究：利用FGF21、adropin基因敲除小鼠深入研究其代谢相关表型，通过葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验实验，研究FGF21或adropin缺失对肝细胞内质网应激等细胞应激状态的影响；阐明其对各个主要代谢组织（脂肪、肝脏、肌肉）的能量代谢、胰岛素抵抗、MUP1含量、脂质沉积和脂肪细胞功能产生的效应。

3.探索血清脂肪细胞因子/肝脏细胞因子作为非酒精性脂肪肝、肝脏胰岛素抵抗、糖尿病及其血管并发症的风险预测和早期诊断价值：利用已建立的单克隆抗体-免疫检测试剂盒的技术平台，在课题1建立的上海地区5年随访社区人群和地区13年随访人群中，研究血清脂肪细胞因子（A-FABP,lipocalin-2 和adiponectin）以及肝脏细胞因子（FGF21和adropin）水平和肝脏病变的发生规律，用H1MRS定量方法评估不同方法（生活方式和盐酸小檗碱干预治疗16周）降低非酒精性脂肪肝患者肝脏脂肪含量的疗效；评估上述脂肪及肝脏细胞因子是否可用于非酒精性脂肪肝、糖尿病以及心血管疾病的风险预测、早期诊断以及疾病进展的监测。

4.肝脏miR-29家族小RNA在肝脏细胞内质网应激和胰岛素抵抗发生中的作用：分析miR-29家族各成员在肝脏胰岛素抵抗及脂肪肝状态下的表达特征，确定miR-29家族各成员在肝脏中的靶位及其和肝脏细胞应激信号传导中的作用，阐明miR-29家族在肝脏脂肪性病变和胰岛素抵抗发生过程中的作用。

5.中枢神经系统在肝脏内质网应激及胰岛素抵抗发生过程中的作用：利用中枢神经系统特定神经细胞基因敲除小鼠，研究神经细胞内信号通路及相关重要蛋白因子对肝脏内质网应激状态和胰岛素抵抗发生的作用。

6.建立基于脂肪/肝脏细胞因子和脂肪-肝脏中轴的新药开发平台：根据上述研究结果，评估脂肪/肝脏细胞因子作为脂肪肝及胰岛素抵抗等疾病治疗药物的开发潜力，配合化学生物学的方法，建立基于脂肪-肝脏中轴的新药开发平台。并最终将所得有效化合物在动物模型上进行疗效验证，以期获得具有自主知识产权的肝脏脂肪性病变及胰岛素抵抗的治疗药物。

经费比例：18% 

承担单位：中国科学院广州生物医药与健康研究院、复旦大学、华中师范大学、

中国医学科学院 

课题负责人：徐爱民 

学术骨干：吴东海、盛国庆、高鑫、黄青阳、常永生

课题5：线粒体氧化应激介导糖尿病肾病的分子机制

预期目标：从线粒体能量代谢角度，探讨UCP2介导糖尿病肾病足细胞损伤的分子机制；从细胞自身稳态调节和异常转分化的角度，探讨足细胞在高糖环境下由氧化应激和内质网应激介导的蛋白尿和肾小球硬化的分子机制，寻找减少足细胞凋亡、蛋白尿的新方法。探讨氧化损伤白蛋白诱导血管细胞的应激和损伤，促进加速性动脉粥样硬化的发生和发展的分子机制。为加速性动脉粥样硬化发现新理论，寻找新的致病分子、致病环节，探索新的干预途径。

主要研究内容：

1.UCP2介导糖尿病肾病足细胞损伤的分子机制：探讨糖尿病的肾小球足细胞是否存在UCP2异常表达，以及足细胞数目和形态的变化与UCP2蛋白表达和分布的变化规律与特点；通过探讨UCP2蛋白缺失对糖尿病肾小球病变的影响，以及与肾小球组织形态和肾功能变化的关系，明确UCP2在糖尿病肾病早期病变中的作用；研究足细胞UCP2蛋白缺失的细胞形态和生物学功能的变化，以及足细胞UCP2蛋白拮抗高糖导致足细胞损伤的作用及其机制，明确UCP2对保护足细胞的作用与机制。

2.氧化应激、内质网应激在糖尿病肾病蛋白尿和肾纤维化中的作用：运用TUDCA，从细胞应激入手，从实验动物、细胞水平寻找减少足细胞凋亡、蛋白尿、细胞外基质（ECM）积聚，治疗糖尿病肾病的新方法。在糖尿病肾病小鼠模型中，用TUDCA 主动干预足细胞EMT，观察小鼠肾组织病理、尿蛋白、足细胞凋亡率、足细胞标记蛋白、内质网应激指标、线粒体氧化应激指标、细胞自噬标记蛋白、转分化（EMT）标记物等的变化。体外培养小鼠肾脏足细胞，观察糖基化终末产物、高糖、血管紧张素II、TGF-β是否导致线粒体氧化应激和内质网应激指标、细胞自噬标记蛋白、EMT标记物的异常变化。

3.氧化损伤白蛋白在糖尿病血管病变中的作用：研究氧化损伤白蛋白对血管固有细胞（血管内皮细胞和血管平滑肌细胞）表达功能性抗原和受体、氧化还原状态、合成和释放炎症、血管舒缩等生物活性分子、以及细胞转分化的影响；氧化损伤白蛋白对血管内皮细胞凋亡和血管平滑肌增殖和细胞周期的影响；对低密度脂蛋白（LDL）氧化和过氧化的影响以及对巨噬细胞和血管平滑肌细胞生成泡沫细胞的影响。探讨氧化损伤白蛋白激活血管固有细胞的受体途径，阐明氧化损伤白蛋白与其受体相互作用的活性结构及其对细胞受体表达的作用及机制；阐明氧化损伤白蛋白诱导细胞内氧化应激的关键酶系统及其方式，研究氧化损伤白蛋白导致血管病变的受体后信号传递和基因；研究氧化损伤白蛋白与血管组织局部RAS活化之间的相互关系。通过阻断氧化损伤白蛋白与受体的相互作用、阻断氧化损伤白蛋白的信号通路、清除细胞内ROS、抑制NADPH氧化酶活性、激活转录因子-过氧物酶体增殖剂激活受体或抑制RAS活化，观察对血管固有细胞损伤的作用以及对加速性动脉粥样硬化进展的影响，从而进一步证实氧化损伤白蛋白在加速性动脉粥样硬化中的作用，并为其防治提供新靶标。

经费比例：13.7% 

承担单位：南京医科大学、南方医科大学、中山大学附属第一医院

课题负责人：杨俊伟 

学术骨干：侯凡凡、余学清

课题6：氧化应激导致2型糖尿病大血管损伤的机制研究

预期目标：阐明与2型糖尿病大血管病变直接相关的内皮细胞和平滑肌细胞代谢和氧化应激变化图谱；获得血液或尿液中可用于糖尿病心血管并发症早期诊断和病情监测的特异性分子标记物，筛选出存在于糖尿病病人呼吸气体中代谢相关分子标记；为将GLP-1用于糖尿病心血管病并发症的防治提供基础和临床研究资料。

主要研究内容：

1.大血管内皮细胞和平滑肌细胞在糖尿病心血管并发症发生中的代谢和氧化应激的特征谱研究：以正常大鼠和糖尿病模型大鼠的主动脉内皮细胞和平滑肌细胞为研究对象，采用代谢组学和蛋白组学研究方法，研究其在慢性高血糖刺激后所发生的形态学、氧化应激变化；对相关细胞开展蛋白质组学研究，开展代谢组学分析；采用质谱分析方法，检测这些细胞外吐小体中的蛋白在病变前后的变化；综合上述结果，阐明大血管内皮细胞和平滑肌细胞在糖尿病心血管并发症发生中的代谢和氧化应激变化。

2.2型糖尿病伴心血管病变患者的呼吸气体代谢相关标记分子的筛选：选取年龄、性别等严格匹配的正常人，2型糖尿病患者，2型糖尿病伴发心血管并发症的人群为研究对象（每组50-60人），采用质谱分析法，比较这些人群呼吸气体中代谢相关有机成分的差异；采用蛋白质组学技术，比较分析其血液和尿液标本组别间蛋白质谱的差异。

3.GLP-1用于糖尿病心血管病并发症防治的基础和临床研究：体外观察GLP-1对糖尿病动物模型和ApoE（-/-）基因敲除动物大血管内皮细胞和平滑肌细胞的影响。体内实验中测定活体动物心血管指数的改善指数，主动脉内皮细胞和平滑肌细胞的病理改变，和相关的氧化应激分子表达的变化。在此基础上，开展GLP-1的临床前应用研究。研究GLP-1对2型糖尿病心血管并发症患者的糖代谢、脂代谢、胰岛素敏感性、胰岛功能、心电图、心功能等的影响。

经费比例：12% 

承担单位：南方医科大学、同济大学 

课题负责人：惠宏襄 

学术骨干：陈义汉、孙云甫、唐永明、赵小宁

课题间相互关系：

课题1可与课题2紧密互动，通过不同样本人群验证遗传因素与环境因素的相互作用。课题1和2发现的易感基因和营养因素可在课题3、4、5、6 中进一步研究其对β细胞功能、胰岛素抵抗、糖尿病肾病和糖尿病大血管病变中的作用机制。课题3、4、5、6 中发现的细胞应激反应关键因子可在课题1中进一步研究其是否参与中国人2 型糖尿病及并发症的遗传易感性；在课题2中研究其是否参与营养因素诱发2型糖尿病的分子机制。课题1和2可为所有细胞应激机制研究课题组提供临床标本，以深化研究。

各课题与项目总体目标和五年目标的关系如下：课题1着重开展影响2型糖尿病发生发展的易感基因研究；并开展表观遗传学研究。该课题的研究成果可为2型糖尿病及并发症易感人群的早期检出提供支持。该课题组还可提供临床样本支持，并提供葡萄糖钳夹技术平台与其他课题组共享。课题2主要研究营养因素与2型糖尿病的关系，以及遗传因素与营养因素在2型糖尿病发生发展上是否存在交互作用。该课题有望为建立适合中国汉族人群遗传背景和膳食特点的2型糖尿病营养干预策略提供理论依据。课题3围绕内质网应激导致胰岛β细胞凋亡的作用机制开展研究，揭示内质网应激在脂肪酸和炎症因子诱导的胰岛β细胞凋亡过程中的分子机制, 为2型糖尿病的治疗提供潜在的新靶点。课题4研究内质网应激在肝脏胰岛素抵抗中的作用，探讨脂肪因子及肝细胞因子的代谢调节功能及分子作用机理，为脂肪因子及肝细胞因子用于2型糖尿病发生发展的早期风险评估提供理论基础及临床依据。课题5研究线粒体氧化应激诱导肾脏足细胞损伤和糖尿病肾病的作用机制，重点研究糖尿病足细胞转分化、细胞稳态、以及与足细胞生物学功能密切相关的线粒体能量代谢和内质网应激。课题6研究氧化应激与2型糖尿病大血管病变及心脏病变的关系。

四、年度计划

一、研究内容

本项目的关键科学问题是：发现遗传、环境因素及其相互作用在2型糖尿病发生发展中的作用；围绕细胞应激，阐明引起2型糖尿病病理生理变化的分子机理。

遗传因素和环境因素相互作用导致2型糖尿病的发生与发展。中国人无论是遗传因素、还是营养结构都与国外人群存在很大差异。因此，本项目将针对中国人群自身特点，揭示遗传、环境和营养因素对2型糖尿病发生发展的作用机制；同时以细胞应激为研究切入点，阐明2型糖尿病发生发展过程中，胰岛、肝脏、肾脏、心血管等重要组织器官损伤的分子机理，揭示其导致糖尿病病理生理变化的内在规律。探讨遗传、环境因素以及细胞应激反应的关键分子在2型糖尿病发生发展的早期预警和早期干预上的作用。将从以下6个方面开展相关研究：

1)利用已建立的大样本横断面、前瞻人群，采用最新的全外显子组深度测序，开展易感基因研究；针对细胞应激关键因子开展基因变异与2型糖尿病及并发症的关联研究；并针对易感位点开展功能研究；研究遗传因素与环境因素（生活方式、饮食习惯等）相互作用对糖尿病发生发展的影响；另一方面，将利用深度测序在全基因组水平研究2型糖尿病与主要靶组织甲基化的关系；研究肿瘤与糖尿病、细胞端粒与糖尿病转归的关系，为全面认识遗传因素与环境因素对于2型糖尿病的发生与发展的影响做出有力的补充。

2)在已有的人群流行病学研究和2型糖尿病的全基因组关联研究基础上，根据中国人群特定的营养结构和遗传易感性，围绕着影响糖脂和能量代谢的重要营养素（如脂肪酸、维生素D、B族维生素及矿物元素），对营养素失衡及其相关基因在2型糖尿病发生发展过程中的作用及机制进行深入研究。

3)借助糖尿病内质网应激模型动物，确定易感基因在胰岛β 细胞内质网应激诱导细胞凋亡中的作用，探讨高尿酸、胃绕道手术等特殊环境对胰岛β细胞损伤和保护的独特机制；通过功能基因组学等技术深入研究脂肪酸通过FOXO1诱导胰岛β细胞内质网应激的关键信号分子和信号转导通路；为2型糖尿病的治疗提供潜在的新靶点。

4)利用基因敲除小鼠模型，对adiponectin、A-FABP、lipocalin-2等新脂肪细胞因子在非酒精性脂肪肝和肝脏胰岛素抵抗发生过程中的作用进行研究；阐明其在肝脏中的作用及其在调节细胞应激反应中的信号通路；明确肝脏miR-29家族小RNA等在脂肪及肝细胞因子信号传导中的作用；利用小动物和大动物模型揭示FGF21，adropin 和MUP1等新肝细胞因子在脂肪细胞功能、能量代谢和胰岛素敏感性方面的功能。探索脂肪细胞因子/肝细胞因子作为中国人群2型糖尿病及其血管并发症的风险预测和早期诊断的可行性。

5)从线粒体能量代谢角度，探讨UCP2介导糖尿病肾病足细胞损伤的分子机制；重点研究细胞应激在糖尿病肾病蛋白尿和肾纤维化中的分子机制；从细胞自身稳态调节的角度出发，着重探讨糖尿病足细胞损伤中氧化应激和内质网应激介导自噬反应异常的分子机制，并寻找减少足细胞凋亡和蛋白尿的新方法；探讨氧化损伤白蛋白诱导血管细胞的应激和损伤，促进加速性动脉粥样硬化的发生和发展的分子机制；为发现糖尿病肾病早期标志和新干预途径提供依据。

6)采用代谢组学和蛋白组学研究方法，研究正常大鼠和糖尿病模型大鼠的主动脉内皮细胞和平滑肌细胞在慢性高血糖刺激后所发生的形态学、氧化应激和代谢学变化；检测细胞外吐小体的蛋白质变化；观察GLP-1对糖尿病动物模型大血管内皮细胞和平滑肌细胞的影响，并通过体内实验研究其对活体动物的心血管指数、主动脉内皮细胞和平滑肌细胞病理改变的影响，以及对相关氧化应激分子表达变化的影响；筛选出糖尿病大血管并发症早期诊断和病情监测的特异性分子标记。