干旱胁迫对坡柳等抗旱树种幼苗膜脂过氧化及保护酶活性的影响

V o.l 26 N o .1 BULLET I N OF BOTAN ICAL RESEARCH Jan ., 2006

基金项目:国家/十五0科技攻关课题(2001BA606A-07-01)

第一作者简介:陈少瑜(1968)),女,副研究员,从事林木遗传和生理方面的研究工作。收稿日期:2005-02-24

干旱胁迫对坡柳等抗旱树种幼苗膜脂过氧化及保护酶活性的影响

陈少瑜1

郎南军1

贾利强2

吴丽圆

1

(1.云南省林业科学院,昆明 650204)(2.北京林业大学,北京 100083)

摘 要 以金沙江干热河谷主要树种坡柳、银合欢、山毛豆实生幼苗为材料,通过盆栽苗自然干旱胁迫,同时以浇水处理为对照,研究了干旱胁迫对坡柳、银合欢、山毛豆3个树种丙二醛含量、膜相对透性及保护酶活性的影响。结果表明,干旱胁迫下3个树种幼苗的细胞膜透性、M DA 及SOD,POD 酶活性都发生了变化,只是变化的幅度和进程不同。干旱胁迫对银合欢膜系统损伤生成的

主要降解产物不是MDA;山毛豆清除活性氧毒害作用主要不是通过SOD 和P OD 的作用;通过叶片相对保水力测定及膜透性、MDA 相对含量、酶活性变化情况的分析,3个树种中坡柳耐旱性最强,其次为银合欢,山毛豆居后。

关键词 坡柳;银合欢;山毛豆;干旱胁迫;脂膜过氧化;保护酶

E ffects of drought stress on li pid peroxi dati on and activity of defense enzy m es of Dodonaea viscosa ,Leucaena leucocephal a and Tephrosia candi da seedli ngs

C HEN Shao -Yu 1

LANG N an -Jun 1

JI A L-i Q iang 2

WU L-i Yuan

1

(1.Y unnan A cade m y o f F orestry ,K un m ing 650204)(2.Be iji ng Fo restry U niversit y,B eiji ng 100083)

Abstract Tak i n g seedlings o f Dodonaea viscosa,L eucaena leucoce phala and Tephrosia candida fro m Jin Sha R i v er as m aterials ,the effects o f dr ough t stress on their lipid perox i d ati o n and acti v ity o f defense en -zy m es under natura l drought stressw ere stud ied i n contrast to effects under w atering .The resu lts sho w

t h at the cyto m e m brane per m eab ility ,MDA conten,t SOD and POD acti v ity are allm ore or less changed under drought stress a lthough the ex tent and process of variation is d ifferen.t As for L eucaena leucocepha-la seed li n gs ,MDA is not the m ai n product of lipi d perox i d ation and Tephrosia candida seedlings do not on l y re l y on SOD and POD acti o n to reduce active oxygen conten.t Through co m prehensive analysis on w ater ho l d i n g capacity o f lea,f cyto m e m brane per m eab ility ,MDA content and SOD,POD activ ity ,D odonaea viscosa seedli n gs sho w the highest dr ough t resistance ,then L eucaena leucocephala,T ephrosia candida the las.t

Key words Dodonaea viscosa;L eucaena leucocephala;Tephrosia cand i d a ;drought stress ;lipid per ox-i dation;defense enzy m es

植物在受到干旱胁迫时,细胞中生物活性氧的积累是造成细胞伤害乃至死亡的主要原因。大量

研究表明,植物体内过剩氧自由基的毒害之一是导致脂膜过氧化作用,造成膜系统的损伤,严重时导

1材料与方法

1.1材料

试验材料为坡柳(Dodonaea visco s a)、银合欢(L eucaena leucocephala)和山毛豆(Tephrosi a candi-da)2~3年实生幼苗。将各树种20株分别栽种于同样大小的装有等量、同土质的盆内,幼苗浇以充足的水后,各树种分成2组,同时进行自然干旱和正常浇水处理。2种处理皆每2~3d取1次样,进行以下指标的测定,直至干旱处理组大部分植株萎焉。

1.2方法

1.2.1叶片相对含水量的测定

剪下叶片后立刻称鲜重,然后将它们放在烧杯中,黑暗中放置24h后称饱和重,之后于鼓风烘箱中80e烘干48h,称干重。3次重复,取平均值,计算该次取样植物叶片的相对含水量。

公式:R W C(%)=(鲜重-干重)/(饱和重-干重)@100%

1.2.2质膜相对透性用电导仪法测定[3]

具体方法为:取5m L蒸馏水置于10mL试管中,测电导率(E0);取0.1g叶片,放到蒸馏水中,室温放置3h,测电导率(E1);之后煮沸10m i n,测电导率(E2)。3次重复。计算相对电导率(E)。

公式:E=(E1-E0)/(E2-E0)

1.2.3MDA含量的测定

采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[4]。具体方法为:取3支试管,1支为对照管,其内加入0.5mL 蒸馏水,另2支为测定管,内各加入0.5m L酶粗提液。3支试管分别加入2.5mL0.5%的TBA(用20%三氯乙酸配制),100e水浴30m i n、速冷, 1800r#m in-1离心10m i n,取上清液,测定450、532和600n m处的吸光度值,按公式(1,2)计算出MDA 浓度,再算出单位鲜重中的MDA含量(L mo l#g-1)。

公式:MDA=[6.45@(D532-D600)-0.56 D450](1)

1.2.4SOD活性的测定

参照参考文献[5]的方法,以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位。

公式:SOD总活性=(A CK-A E)@V/0.5@A CK @W@V t(2)

(A CK为照光对照管的OD值;A E为样品管的OD值;V为样品总体积;V t为测定时样品用量;W 为样品鲜重)

SOD比活性=SOD总活性/蛋白质含量

1.2.5POD活性测定

采用愈创木酚显色法[5]。隔1m in记录1次吸光度,以每分钟内变化0.01为1个酶活性单位。

公式:POD活性=$OD470@V/W@0.01@V t@t

(3)

2结果与分析

2.1干旱胁迫对叶片相对含水量的影响

自然干旱胁迫过程中,与对照相比,3个树种叶片的相对含水量皆逐渐下降,但不同的树种下降的时间与速率不同,见表1。由表1可以看到,山毛豆叶片相对含水量在干旱胁迫处理的第9d开始明显下降,且下降速率较快,由开始胁迫处理的74.66%下降到第15d的48.8%,第15d时,受胁迫山毛豆叶片的相对含水量仅为对照的67.2%,下降速率为每天2.19%。银合欢叶片相对含水量从胁迫处理的第13d开始出现明显下降,由开始的70.45%到第17d实验结束降到52.46%,第17d 胁迫处理为对照的73.7%,下降速率为1.55%每天。坡柳叶片相对含水量从第11d开始下降,但下降速率比较平缓,从开始实验的66.77%下降到第21d的45.3%,下降速率为1.51%,第21d胁迫处理为对照的68.2%。根据各树种胁迫处理后出现叶片相对含水量下降的时间及下降速率,将3个树种叶片的保水能力进行了排序,由强到弱依次为:坡柳、银合欢、山毛豆。详见表2。

1期陈少瑜等:干旱胁迫对坡柳等抗旱树种幼苗膜脂过氧化及保护酶活性的影响表13个种干旱胁迫期间叶片相对含水量的变化

T able1Changes of leaf re l a tive wa ter content of3species seed li ngs duri ng drought stress

相对含水量(R W C)(%)树种

胁迫时间(天)T i m e of drough t s tress(days)

0479111315171921

山毛豆(W) T.cand i d a 74.66?

0.48

75.35?

1.17

73.17?

1.58

72.22?

0.94

71.46?

1.09

74.68?

1.11

72.?

0.46

山毛豆(D) T.cand i d a 73.27?

0.10

74.36?

1.31

71.69?

0.90

68.?

0.63

63.94?

1.72

58.30?

0.59

48.80?

1.40

D/W(%)98.1498.67.75.0.278.167.2

银合欢(W) L.le ucoce pha l a 70.70?

0.81

70.95?

0.79

70.61?

0.42

70.77?

0.67

71.10?

0.61

70.46?

0.72

70.87?

0.82

71.21?

0.24

银合欢(D) L.le ucoce pha l a 70.45?

0.61

70.29?

0.79

70.45?

0.82

70.52?

0.67

70.42?

0.20

69.50?

1.13

58.88?

0.42

52.46?

2.41

D/W(%)99.599.199.7799.699.098.685.973.7

坡柳(W) D.visc osa 66.77?

0.47

.63?

0.87

68.21?

0.77

66.03?

0.47

65.32?

0.06

65.43?

0.35

65.11?

0.26

65.56?

0.34

65.83?

0.54

66.42?

0.41

坡柳(D) D.visc osa 65.09?

1.

63.56?

0.81

65.07?

0.39

65.19?

0.21

63.86?

0.85

59.50?

0.10

55.56?

0.76

48.92?

1.06

46.34?

1.06

45.30?

1.59

D/W(%)97.48.195.4098.7298.590.9482.374.670.468.2注:W:表示浇水处理;D:表示干旱处理;R W C(rel ati ve water con tent):相对含水量

表23个树种叶片保水力的排序

T ab le2O rders for wa ter conservati on of3species seed li ngs

树种Speci es

RW C明显下降

Days ofRWC

decreasing obvious l y

实验结束

The end days

实验结束时(D/W)

D/W of R W C i n

end days(%)

下降幅度

Decreas e

range(%)

下降速率

D ecrease rate

(%/day)

保水排序

Capacity of

w ater hol d i ng

山毛豆(T.c and i da)第9d第15d67.232.82.193银合欢(L.l eucoc epha l a)第13d第17d73.326.31.552坡柳(D.v iscosa)第11d第21d68.231.81.511

2.2干旱胁迫对3个树种幼苗叶片质膜透性和膜脂过氧化作用的影响

当植物受到干旱胁迫时,质膜受到不同程度的破坏,进而膜透性(电导率)增大[6],同时细胞中活性氧大量积累,而活性氧含量增高能启动膜脂过氧化和膜脂脱脂化作用[7,8],产生过氧化产物,主要表现为丙二醛(MDA)含量的显著增高。干旱胁迫处理后,山毛豆等3个树种幼苗电导率及M DA含量的变化分别见图1,2。

由图1可知,3个树种的电导率都随着干旱胁迫的加深而增大,但增加的速率和幅度不同。其中,山毛豆和银合欢电导率的变化较一致,到胁迫的第15d,两树种干旱处理的电导率为对照的280%左右,到第17d,银合欢的电导率达到了对照的451.32%,而坡柳的电导率在整个胁迫过程中变化则比较平缓,至实验结束的第21d才为对照的201.70%,说明坡柳膜系统抗干旱损伤的能力更强些。图2显示了胁迫过程中M DA含量的变化,3个树种中,银合欢幼苗叶片的MDA含量变化不大;而山毛豆的M DA含量在干旱胁迫的第13d急剧上升,达到了32.26L m ol#g-1,为对照的183.2%;坡柳幼苗叶片的MDA含量在轻度胁迫下缓慢增加,重度胁迫时(第19d)则迅速增加,达20.32L mo l#g-1,为对照的254.32%。

90植物研究26卷图1干旱胁迫对电导率的影响

F ig.1E ffects of drough t stress on relative

conducti v ity rate

图2干旱胁迫对M DA含量的影响

F i g.2Effects o f drought stress on M DA

re lati ve conduc tiv ity

综合膜透性及MDA的变化情况,在整个干旱胁迫过程中,山毛豆和坡柳幼苗叶片相对膜透性增大,MDA含量增多,且二者变化趋势一致,表明两树种幼苗的膜系统受到了损伤,并且这种损伤与膜脂过氧化作用密切相关。而银合欢膜透性在胁迫的第9d以后大幅度增加,但M DA含量变化却较平稳。银合欢膜透性以何种方式受到破坏,产生了何种降解产物有待于进一步研究。

2.3干旱胁迫对坡柳等幼苗SOD及POD酶活性的影响

在正常情况下,植物体内活性氧产生与清除处于平衡状态,不会导致细胞伤害,氧自由基的清除剂可分为酶促和非酶促两大类[9,10],其中酶系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(C AT),三者协同作用,使植物自由基维持在一个低水平上,从而防止自由基对植物的伤害[11]。当植物受到胁迫时,植物体内产生大量的

氧自由基,此时清除过剩氧自由基的保护酶系统的

图3干旱胁迫对SOD酶活性的影响

F i g.3E ffects of drough t stress on SOD

图4干旱胁迫对POD酶活性的影响

F i g.4E ffects of drought stress on re l a tive

activity o f POD

活性便会发生相应的变化,图3,图4为干旱胁迫下3个树种SOD和POD酶活性的变化情况。

图3显示了干旱胁迫期间3个树种SOD酶活性的变化情况。总体上3个树种SOD总酶活性差异不大。在整个干旱胁迫过程中与对照相比,3个树种叶片SOD酶活性的变化比较平缓。轻度胁迫下银合欢和坡柳SOD活性有一个较大的上升,分别为对照的178.79%和142.38%,之后便趋于平缓,而山毛豆则在轻度胁迫时SOD活性稍有下降,之后也趋于平缓。图4中,3个树种受干旱胁迫后POD酶活性总体呈现上升的趋势。其中山毛豆上升幅度不是很大,中重度胁迫下山毛豆POD酶活性略高于对照,比对照高9.8%,而银合欢和坡柳的POD酶活则有较大幅度的上升,分别比对照高了243.98%和258.8%。综合上述结果,在干旱胁迫过程中,山毛豆叶片两种酶活性的变化比较平缓,说明山毛豆氧自由基的清除主要不是通过SOD和POD两种酶系统的作用,而是由其它酶促或者非酶促作用清除过剩氧自由基。银合欢和坡柳在轻

91

1期陈少瑜等:干旱胁迫对坡柳等抗旱树种幼苗膜脂过氧化及保护酶活性的影响

度胁迫时,SOD酶活大幅度增强,中重度胁迫时POD酶活性又大幅度提高,通过两种酶的协同作用消除或减小活性氧对植物细胞膜系统的损伤。

3讨论

许多逆境下,植物体内发生氧化胁迫,破坏了活性氧代谢系统的平衡。活性氧水平增高,从而发生脂膜过氧化和膜蛋白的聚合作用,使细胞膜系统变性,进而导致细胞的损伤甚至死亡。具体表现为细胞膜透性的增大,脂膜过氧化产物,如MDA等物质含量的升高。与此同时,植物体内清除活性氧的酶类和非酶类系统也积极参加反应以清除或减轻活性氧对细胞的损害,其中对酶系统,即SOD、POD、C AT等3种酶系统的研究较多[12~14],对于不同植物、不同品种或不同生态型,各种酶活性的大小、抗氧化的能力有所不同。本文对干旱胁迫下山毛豆、银合欢及坡柳的膜脂过氧化和保护酶活性化情况的研究结果表明,干旱胁迫下3个树种幼苗的细胞膜透性、MDA、SOD及POD酶活性都发生了变化,只是变化的幅度及进程不同。

干旱胁迫下,耐旱品种比不耐旱品种具有较低的电解质外渗率和较低的MDA含量。从3个树种电导率变化情况看,坡柳电导率变化平缓且相同的相对变化量所需时间要长,因此,坡柳比前两树种更耐干旱。从3个树种MDA变化情况看,银合欢的MDA没有太大的变化,坡柳MDA变化较迟缓且幅度皆小于山毛豆,说明坡柳对干旱的抵抗能力更强一些。这与3个树种叶片保水力测定和排序结果相同,即坡柳的抗旱保水能力位于3个树种首位。

在整个干旱胁迫过程中,银合欢MDA变化较平缓,最大幅度仅6.72%,说明对于银合欢来说,干旱胁迫对膜系统的损伤主要不是通过膜脂过氧化作用,生成了其它主要降解产物而非MDA,王邦锡等也有类似的研究结果[15]。

大量研究表明,逆境下机体内SOD,POD,CAT 等酶类系统的活性会有所提高,以利于体内氧自由基的清除,这是生物体减轻活性氧毒害的主要方式,但也存在非酶类系统的作用。本研究的3个树种,山毛豆便是一个例子,测定的两种酶SOD和POD活性几乎没有变化,推测此树种便是通过其它方式清除活性氧的毒害作用。银合欢和坡柳SOD和POD两种保护酶的活性在干旱胁迫的进程中变化趋势相同,只是出现变化的时间和幅度不同。轻度胁迫下,两树种SOD活性升高,而重度胁迫时,SOD活性下降,POD活性上升。SOD是一种诱导酶,受底物浓度的诱导,说明干旱促进银合欢和坡柳幼苗叶片活性氧的生成,诱导SOD活性增加。于是由SOD歧化活性氧产生的H2O2必然增多,进而清除H2O2的两种重要酶CAT,POD活性开始增高,因此,胁迫后期两树种POD酶活性急剧上升以消除或减轻H2O2的毒害。

参考文献

1.陈少裕.脂膜过氧化对植物细胞的伤害.植物生理学通

讯,1991,27(2):84~90

2.曹锡清.脂质过氧化对细胞与机体的作用.生物化学与

生物物理进展,1986,2:17~23

3.王韶唐主编.植物生理学实验指导.西安:陕西科学技

术出版社,1987.149~151

4.张文玲,王林嵩,马剑敏,等.萝卜营养生长期超氧化物

歧化酶活性和丙二醛含量的变化.广西植物,2000,20

(4):347~350

5.龚富生,张嘉宝.植物生理学实验.北京:气象出版社,

1995

6.王洪春.植物抗性生理.植物生理学通讯,1981,17(2):

72~81

7.吕庆,郑荣梁.干旱及活性氧引起小麦膜脂过氧化与脱

脂化.中国科学#C卷,1996,26(1):26~30

8.沈秀瑛,徐世昌,戴俊英.干旱对玉米S OD、CAT及酸性磷

酸酶活性的影响.植物生理学通讯,1995,3(3):183~186 9.蒋明义,郭绍川.水分亏缺诱导的氧化胁迫和植物抗氧

化作用.植物生理学通讯,1996,32(2):144~150

10.M i shra N P,M ishra R K,si ngha l G S.Changes i n the ac-

tiv ities of ant-i ox i dant enzymes dur i ng exposure of intact wheat l eaves to strong v isi b le light a t d ifferen t te m peratures

i n the presence o f prote i n synthesis i nhi b itors.P l ant Phys-i

o,l1993,102:903~908

11.孙国荣,彭永臻,阎秀峰,等.干旱胁迫对白桦实生苗保

护酶活性及脂质过氧化作用的影响.林业科学,2003,

39(1):165~167

12.刘宁,高玉葆,贾彩霞,等.渗透胁迫下多花黑麦草叶内

过氧化酶活性和脯氨酸含量以及质膜相对透性的变化.植物生理学通讯,2000,36(1):11~14

13.刘怀攀,陈龙,张承烈,等.渗透胁迫和外源A B A对芦

苇愈伤组织中3种保护酶活性的影响.植物生理学通讯,2000,38(1):27~29

14.孙昌祖.渗透胁迫对青杨叶片氧自由基伤害及膜脂过

氧化的影响.林业科学,1993,29(2):104~108

15.王邦锡,孙丽,黄久长.渗透胁迫引起的膜损伤与膜质

过氧化和某些自由基的关系.中国科学#B卷,1992

(4):3~368

92植物研究26卷