SDS碱裂解法制备质粒DNA

1．5ml LB (或添加相应抗生素)接菌，过夜培养37℃  250rpm

2. 离心菌体，12000rpm   30s  或 8000rpm  5min

3．弃上清，尽可能吸干培养液，加100μl Solution  (预冷)（+5μl RNaseA），vortex，重悬菌体

4．加200μl solution （新鲜配制），快速颠倒5次，勿振荡，室温放置≤5分钟

5．加150μl solution （预冷），颠倒数次，冰上放置3－5分钟

6．12000rpm  15min  上清转移到新管中

7．上清加等体积酚：氯仿（1：1），振荡混合，12000rpm  5min 离心，吸上清到新管，重复抽提至中间无白色

8．上清加2－3倍体积无水乙醇＋1/10体积NH4Ac ，混匀，冰上（或-20℃）放置15min，12000rpm离心15min

9．小心倒去上清，加500μl－1ml  70%乙醇，冲洗DNA沉淀，不要将沉淀吹起，若吹起沉淀，则应重新离心

10．37℃培养箱放置5－10min ，开口平放，吹干酒精

11．溶于适量TE(可在TE中加RNaseA消化RNA，或于Solution中加RNaseA过程中消化RNA)

12．电泳检测

附：

1．LB培养基

酵母粉（膏）   0.5g

蛋白胨         1.0g

NaCl           1.0g 

水             100ml

pH7.2～7.4    

固体培养基加琼脂粉1.5～2.0g

灭菌：121℃(0.1MPa)  20min

常用抗生素浓度：

Amp  母液浓度为 100 mg/ml  in 水    工作浓度为100μg/ml    （100ml LB+100μl Amp）

Chl   母液浓度为 20 mg/ml  in 乙醇    工作浓度为100μg/ml   （100ml LB+500μl Chl）

Kan   母液浓度为 10 mg/ml  in 水     工作浓度为50μg/ml    （100ml LB+500μl Kan）

Tet    母液浓度为 5 mg/ml  in 水      工作浓度为10μg/ml    （100ml LB+200μl Tet）μμ

2．TE： Tris－HCl    10mmol/L

EDTA       1mmol/L        （pH8.0）需灭菌

取母液 Tris－HCl（pH8.0） 1M   1ml

       EDTA （pH8.0）  0.5M   0.2ml

       加水至100ml

（母液最好也灭菌）

3．质粒提取solution：50mM  Glu

                     25mM  Tris－HCl（pH8.0）

                     10mM  EDTA （pH8.0） 灭菌  105℃  4℃保存

      取母液： Glu                1M    10ml

               Tris－HCl（pH8.0）  1M    5ml

               EDTA （pH8.0）   0.5M    4ml

                                  加水至  200ml

4．质粒提取solution:  0.2M NaOH --1%SDS（m/V）现用现配，室温下使用

配制0.4M NaOH    2%SDS     1：1混合

0.4M NaOH  100ml  取1.6g

2%SDS      100ml  取2g

5．质粒提取solution:  4℃保存

配5M KAc： 取29.442g KAc 配60ml

再加HAc   11.5ml   

水    28.5ml

用HCl调pH4.8           定容100ml