3T3-L1细胞培养

一、复苏冻存的3T3-L1细胞

1 从液氮罐中用镊子拿出冻存的细胞，迅速放入37 ℃浴中，溶解约1min 取出（要留小部分冰不融化）。

2 打开前用75%的酒精清洗冻存管外壁，打开后，移入小号培养瓶，立即加入4~5mL培养基，稀释DMSO，然后放入培养箱。

二、冻存的3T3-L1细胞

1 当细胞长到70~80%时，消化细胞。去除培养基，用5mL 1*PBS 洗去残留培养基，加入1mL 胰酶，轻晃培养瓶，使胰酶覆盖整个培养瓶底部，放入培养箱消化2~3min。

2 加入3~4mL DMEM(10%NBS) 终止消化，轻轻吹打使细胞均匀。

3 取1/5的量移入大培养瓶继续培养。

4取700uL加入冻存管中，向冻存管中加入100uL DMSO，200uL FBS。放入程序降温盒，再放入-80度冰箱过夜，第二天拿出放入液氮罐，记录存放位置。

5 每消化一次，细胞代数增加一次，要记录清楚。

三、3T3-L1细胞换液

1 新复苏或消化的细胞，在种入新培养瓶5~6h或过夜后，观察细胞贴壁情况。

2 每两天换一次液；待细胞长到70~80%时，进行消化，消化步骤如上所述。

四、种入24孔板

1 种入24孔板前，细胞要进行消化，步骤如上所述。

2 计算好传代和种入板中的量。如：大号培养瓶中细胞长到70~80%进行消化，加入1.5mL胰酶消化，加入4mL 培养基终止消化。其中0.5mL用于继续培养，剩余5mL, 每一24孔板需要1/5的量。

3 24孔板事先铺0.5%的明胶。

注意事项：

1 从液氮中拿出冻存管时尽量不要用手碰，以免冻伤。

2 冻存管取出后迅速放入水浴中，培养基使用前可以先用37度预热。

3 冻存管打开前要用酒精消毒，防止污染。

4 尽快加入培养基稀释DMSO，防止DMSO对细胞毒性作用。

5 冻存复苏细胞遵循“慢冻快融”原则。

6 程序降温盒内是异丙醇，用5次更换一次异丙醇。

7 若没有程序降温盒，可将细胞放入4度冰箱1h，-20度冰箱1h，再放入-80度过夜。

8 贴壁细胞早期开始冻存，70~80%进行消化冻存。

五、3T3-L1细胞培养专用培养基

DMEM：Dulbecco’s Modified Eagle Medium (High glucose; 粉末)

1 DMEM粉末(13.4g)+3.7g NaHCO3+双蒸水定容至1L。

2 加入抗生素10mL(1%)，分成两个500mL, 一个加入NBS 50mL(10%)，另一加入FBS 50mL(10%)，调pH至7.2~7.4。

3 先在外面过滤培养基，0.45um的滤膜过滤一遍，0.22um的滤膜再过滤一遍。

4 再将培养基纳入超菌台中，用事先灭菌的过滤器过滤一遍（两层0.22um滤膜），过滤完后装入500mL试剂瓶中，4度保存。 

P.S. 1 3T3-L1细胞培养时用含10%NBS的培养基，诱导时用含10%FBS的培养基。

   2 过滤时可先过滤含NBS的培养基，再过滤含FBS的培养基。

六、明胶处理培养板

1  0.5%明胶： 0.5g 明胶，100mL DW 溶解，高压灭菌，再用0.22um过滤器过滤一次。

2 每孔加入0.5 mL明胶，待全部加完后，再一次吸出(回收)，将培养板置于无菌台内干燥2~3h，期间紫外照射。

3 封板，用保鲜袋将处理好的培养板无菌封闭，储存备用。

七、 固定细胞，油红染色

1 将24孔板中培养基吸出后，用1*PBS 0.5mL/孔清洗两遍。

2 用4%甲醛固定细胞，暗处1h。

3 用无菌水0.5mL/孔洗两遍，再用100%丙二醇0.5mL/孔清洗2min。

4 加入0.5%油红0.5mL/孔染色。

5 染色结束后，吸出染液，用98%丙二醇清洗一遍，5min。

6 用85%丙二醇洗三遍，每遍5min。

7 加入1*PBS，拍照。

8 拍照完成后，加入无水乙醇0.2mL/孔，洗出油红，5min。每孔吸出150uL加入96孔板中，测OD值。