微生物限度检查方法学验证实验

一、微生物限度检查的意义

二、微生物限度检查的范围

三、验证的目的

四、验证的类型

五、验证的过程一、微生物限度检查的意义

药品是治病防病，关系患者生命健康的特殊商品，必须保证其质量,用药的安全与有效。微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜，在国内外均有报道。为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。其意义在于

(1)保证药品质量已有许多实例表明，药品污染微生物不仅危机病人用药安全，而且也直接影响药品的有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。

(2) 反映药品生产工艺的科学性，合理性及质量管理水平，通过检验，凡工艺条件，生产管理水平，生产人员的素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率无疑就高。微生物限度的检验是提供药品卫生质量的重要依据，因而在保证销售与使用过程中药品的有效性和安全性，是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要措施。二、微生物限度检查的范围

1．根据药品使用要求，把药品化为两大类:

(1) 规定灭菌药品:包括注射剂和输液剂，及用于体腔，严重烧伤,溃疡,出血用药等制剂。

(2) 非规定灭菌药品:包括常用口服制剂与一般外用制剂。对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。由于致病菌的范围很广，各国药典都规定了几个常见的致病菌或指示菌作为控制菌。

2．在非灭菌的各种制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定

(1)染菌量检查:包括细菌数，霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。

(2) 控制菌检查:包括大肠埃希菌，大肠菌群，沙门菌，金黄色葡萄球菌及铜绿假单孢菌，生孢羧菌。

3．药品微生物限度检验中的困难，最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。

(1) 不确定性:药品受外来微生物的污染，这种污染是可有可无;在有中又可多可少;其种类可以多样.污染的情况依生产,设备,原材料,管理,剂型等等条件而定,非药品本身所固有.所以微生物限度检验的对象是不确定的。药品所规定的项目,除无菌检查,热原具有上述性质,其他项均无此特征.这一点往往被忽视.污染对药品而言是一个意外事件。污染批号中的不合格品是一个随机变量。(2) 分布的不均匀性:不均匀性是不确定性的另一种表现形式,在一个批号内产品有的可以被污染,有的不被污染,分布不匀;在被污染的部分中有的数量极多,有的较少,种类上可以复杂或较单一.这种不均匀性源于污染源的复杂性;原辅料污染,工艺污染,空间污染和操作人员污染等等构成污染量的多少差异,形成不均态。再者,微生物具簇团性;簇团大小,紧密程度是可遗传的,簇团的分散性差异极大,该特点无疑强化了不均匀性

(3)活体特征:药典中以活的微生物作为检验对象也是独特特性。

三、验证的目的

确认所采用的方法适合于供试品的微生物限度检查,即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以已被充分消除到可以忽略不计。保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。

四、验证的类型

1．建立药品的微生物限度检查法时。

2．修订的检验方法。

3．供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时。4．定期的验证。

5．同一产品不同批次、不同企业生产的同一产品。

当建立药品的微生物限度检查方法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。

验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行，对各试验菌的回收率逐一进行验证。（一）微生物限度检查样品：

1．首先应是合格的样品。

2．本底微生物太多可以先灭活，但不应因此影响药效。

（二）供试液的制备

制剂形式多样，决定前处理各异

（三）用于微生物限度验证的菌种：菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或

该药品中常见的污染菌)

菌种的要求：不得超过5代,采用适宜的方法保存。

（四）菌种保藏及应用参考方法：

冻干菌种（0代） 100ml液体培养基复苏（1代）

加100ml 20%无菌甘油混匀，1ml/管冻存管分装，-20℃或-80℃

保存

每次使用取1支自然（室温）解冻，取0.1ml接种至10ml液体培

养基（生孢梭菌用12ml硫乙醇酸盐流体培养基）按规定培养、稀释（2代）

1．大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44 102] 革兰氏阴性无芽孢杆菌,两端钝圆,有时近球形

2．金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） [CMCC(B) 26 003] 革兰氏阳性无芽孢球菌

3．枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63 501] 革兰氏阴性芽孢杆菌

4．白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98 001] 酵母菌

5．黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98 003] 霉菌(曲霉属)

五、验证的过程

验证方法：

验证实验至少应进行3次的平行实验，并分别计算各实验

菌每次实验的回收率,为了体现方法的可重复性。

（一）菌液制备

1)．取经37℃培养18-24小时，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌肉汤培养物1ml,+9ml灭菌生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-7

为50~100 cfu/ml，做活菌计数备用。

2)．取经25℃培养18~24小时的白色念株菌霉菌液体培养物1ml + 9ml灭菌生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-7为50~100 cfu/ml，做活菌

计数备用。

3)．取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下

霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，与浊度相当后，取1 ml+ 9 ml盐水=10-1，逐管10倍稀释为10-4约50~100 cfu/ ml，做活菌计数备用。

关于黑曲霉：

转种操作应在生物安全柜中进行，关闭风机，靠近酒精灯操作；

转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121℃湿热灭菌30

分钟再作处理；

菌落计数结果例表

实验次数金黄色葡萄球菌枯草杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌

1 56、60 77、79 81、75 80、76 77、72

2 94、92 53、47 79、74 90、 79、84

3 53、50 78、77 73、7

4 110、100 55、50 （二）回收率测定：

1、常规法

1)试验组: 平皿计数时，取实验可能用的最低稀释级供试液1 ml 和50～100个/ ml 试验菌，同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，待凝固后，臵规定温度培养24～72小时观察结果。

2) 活菌组:测定每一菌株加的试验菌数

3) 供试品对照组:取规定量供试液按菌落计数方法测定本底菌数

4) 稀释剂对照组: 考查稀释液（分散、乳化、中和）制备过程中是否对微生物有影响

回收率=[（试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数/菌液组

的平均菌落数）]×100%

稀释剂对照组的菌回收率=[（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数）]×100%

结果判断：

在3次的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，若实验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数测定供试品的细菌、霉菌及酵母

菌；若任一次试验中试验组的回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性。

计数方法的确定：

细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。

以各试验菌的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。

2、培养基稀释法

取实验可能用的最低稀释级供试液0.5ml、0.2 ml、0.1 ml、和50～100个/ ml 试验菌，同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，待凝固后，臵规定温度培养24～72小时观察结果。

在实验过程中，应注意避免在注皿前菌液和供试液直接接触；

3、薄膜过滤法

（1）供试液制备取供试品10g，加至含20ml十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中（必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量），充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取后，静臵使油水明显分层，取其水层为1：10的供试液。

（2）供试品对照组取供试液1ml（相当于样品1g，1ml）注入开放式滤器，用冲洗液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，消除抗菌作用后，取出滤膜贴于规定的琼脂平板，臵规定温度培养24～72小时，逐日观察结果。

（3）试验组: 取供试液1ml（相当于样品1g，1ml）注入开放式滤器，用冲洗液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，消除抗菌作用后，加入试验菌，每株实验菌平行贴滤膜2个琼脂平板，臵规定温度培养24～72小时观察结果。逐日观察结果。

（4）活菌组:测定每一菌株加的试验菌数

（三）控制菌检查

1.方法的验证

对供试品进行控制菌检查时，应对检查法的科学、准确性进行验证，以确认所采用的方法是否适合该药品的控制菌检查。若药品的组分或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，检查法法应重新验证。

验证时按各品种项下微生物限度规定控制菌选择相应菌株验证，验证大肠菌群检查法时，应用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。（1）菌株：大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌。

（2）菌液制备：将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种营养肉汤、生孢梭菌新鲜培养物接种硫乙醇酸盐流体培养基，培养18-24h，取培养物1ml 用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml含10-100cfu。

（3）验证方法：

①试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取供试液，过滤、冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入增菌培养基中。

②阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、羧菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。

控制菌检查法验证的方法

标准要求验证菌株阴性对照菌菌株检查法

大肠埃希菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌

大肠菌群大肠埃希菌金黄色葡萄球菌大肠菌群

沙门菌沙门菌金黄色葡萄球菌沙门菌

铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌

生孢梭菌生孢梭菌大肠埃希菌生孢梭菌

（4）结果判定：

阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。

验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。

药品微生物限度检查法验证示例

盐酸氨溴索口服溶液

盐酸氨溴索口服溶液 -白色念珠菌(常规法)

试验次数供试液浓度回收率（％）

1 原液100.2

2 原液95.7

3 原液93.5

盐酸氨溴索口服溶液 -黑曲霉(常规法)

试验次数供试液浓度回收率（％）

1 原液85.7

2 原液83.8

3 原液94.4

盐酸氨溴索口服溶液 -金黄色葡萄球菌(常规法) 试验次数供试液浓度回收率（％）

1 原液94.3

2 原液98.1

3 原液95.4

盐酸氨溴索口服溶液 -枯草杆菌(常规法）

试验次数供试液浓度回收率（％）

1 原液85.2

2 原液83.5

3 原液90.4盐酸氨溴索口服溶液 -大肠埃希菌(常规法）

试验次数供试液浓度回收率（％）

1 原液96.2

2 原液88.3

3 原液90.8

控制菌检查

（供试液+大肠埃希菌）（供试液+金葡菌）

BL培养基产酸产

气

MUG－I反应阳性

未产酸产气

结论

盐酸氨溴索口服溶液的细菌、霉菌及酵母菌的计数方法细菌计数：常规法

真菌计数：常规法

控制菌检查方法（大肠埃希菌）：常规法