生物制品-质量标准内容及结构确证内容

检定方法、质控标准

⏹理化性质：外观（形状、颜色、气味）、pH

⏹均一性：纯度、浓度

⏹鉴别

⏹结构确证

⏹效价：生物学活性、免疫学活性

⏹残余杂质：产品、工艺、环境相关的杂质

⏹起草、制定《制造与检定规程》

⏹研究建立国家标准品或参考品

重组蛋白质药物质量标准研究

⏹效价：生物学活性与比活性

⏹蛋白质纯度

⏹蛋白质含量

⏹理化性质鉴定（部分非常规）

⏹残余杂质

⏹安全性及其它项目

一 生物学活性及比活性测定

(一) 检测意义 

获取准确的效价信息，保证产品有效

效价：有效性指标，反映药品效力

生物学活性才能真实反映生物技术药效价

原因：生物制品分子大、结构复杂、不稳定，使得重量与效价不一致

生物制品技术药：~单位（U、AU、IU）

（二） 生物学活性测定方法分类

1、动物基础的活性测定

 离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉

 体内测定法： EPO的小鼠网织红细胞

2、细胞基础的活性测定

⏹促细胞生长法：大多数细胞因子类

⏹抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂

⏹间接保护细胞法：IFN保护WISH

3、酶学基础的活性测定：重组酶类

4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：

 抗原决定簇与活性中心常不一致

（三）生物学活性测定方法选择

1、细胞培养法＞离体器官法＞体内法

2、细胞染色标记方法： MTT ＞3H-Thymidine ＞流式细胞仪 （测细胞周期、凋亡）

3、定量法＞半定量法＞定性法

4、生物学活性不一定与临床药效类型一致

工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。 如rh-GH用HPLC

（四）生物学活性测定（见药典附录ⅩC）

1、样品：原液、成品

2、方法：如上述（好好研究？？？？）

3、标准：

不同生物活性测定方法的规定标准

 测定方法 规定标准

动物基础的活性测定 标示量

细胞基础的活性测定 标示量

酶学基础的活性测定 标示量

结合反应的活性测定 标示量

（五）蛋白质药物的比活性（见分生实验册77页）？？？

1、样品：原液

2、定义与计算：

 比活性：单位重量蛋白的活性单位数（IU/mg)

3、标准：不小于。。IU/mg

4、意义：

1）真实反映有活性的蛋白质所占的比例

 厂家间、表达系统间、批间比较

2）便于配制成品

二 蛋白质纯度检查

⏹样品：原液

⏹方法：必须采用二种方法测定

 非还原SDS-PAGE法

 HPLC法

⏹标准：纯度均须达到95%或98%以上

非还原SDS-PAGE法测定纯度（见药典附录ⅣC）

⏹SDS-PAGE：据分子大小分离

⏹样品处理：样品不加β-ME或DTT

 二硫键未打开，反映单体、二聚体或多聚体情况

⏹染色方法与上样量

 银染:  5ug（检测限为1-10ng）

 考马斯亮蓝R-250：10ug（检测限为0.1ug）

⏹定量方法：凝胶扫描

⏹标准：无明显杂带，纯度≧95%或98%

HPLC法测纯度？？？（见药典附录ⅢB）

⏹分析柱：反相柱、离子柱、分子筛

 应尽量采用反相柱或离子柱

 应注明采用的分析柱性质

⏹上样量：5ug

⏹标准：出峰时间正确 纯度：≧95%或98%

三、蛋白质含量测定(见药典附录ⅥD)

⏹样品：原液、成品

⏹方法：

*Folin-酚试剂法（Lowry法）：（见分生实验册67-73页）

 简便、灵敏、优先采用，灵敏度：5-100ug/ml 

 *染色法（Bradford法）：

 考马斯亮蓝G-250，简便灵敏， 25-200ug/ml

BCA(二喹啉甲酸)法：

操作简单，比Lowry法快4倍且更加方便，准确灵敏：20~200 ug/ml，微量BCA的测定范围在0.5~10 ug/ml。经济适用 ，抗试剂干扰能力比较强。

紫外分光广度法：

 用于原液比活性计算和成品规格控制

四、蛋白质药物理化性质鉴定

（一）特异性鉴别试验

1、样品：原液和成品

2、方法：免疫印迹法

       Western Blot、 Dot Blot

3、标准：应该阳性

（二）相对分子量测定

1、样品：原液

2、方法：还原型SDS-PAGE（见分生实验册51页、见药典附录ⅣC）、质谱法

3、标准：

      1）理论值±10%范围

      2）批与批间一致

（三）等电点测定（见药典附录ⅣD）

1、样品：原液

2、方法：

 ：常规等电聚胶电泳（见分生实验册55-57页）

 ：毛细管电泳

3、标准：

 ）有明显主带

 ）理论值±0.5pH范围

 ）批与批间一致

（四）紫外吸收光谱分析（见药典附录ⅡA）

1、样品：原液

2、方法：紫外扫描

3、标准：

 ）最大吸收波长与特征波长一致

 ）批与批间一致

（五）肽图分析（非常规）（见药典附录ⅧE）

1、样品：原液

2、方法：

 溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/ SDS-PAGE/CE/质谱法

3、标准：

 ）有特征性图谱

 ）批与批间一致

（六）氨基酸组成分析（非常规）

1、样品：原液

2、方法：

 水解（仅用于Trp测定）

 氨基酸自动分析仪

3、标准：

 ）与理论值一致

 ）批与批间一致

（七）氨基酸序列分析（非常规）

1、样品：原液

2、方法：

 末端： 15个残基，

 化学降解法，蛋白质全自动测序仪

 末端： 1-3个残基

 硫氰酸酯/羧肽酶降解法，RP-HPLC

3、标准：

 ）与理论值一致

 ）批与批间一致

（八）其它：二硫键、糖基化（非常规）

五、残余杂质检测

（一）宿主相关杂质

 宿主细胞蛋白含量：（见药典附录ⅨC）

1、样品：原液、成品

2、方法：

 双抗体夹心ELISA：用HAS作保护

 宿主蛋白标准品：中检所提供

3、标准：

 ）大肠杆菌≤0.1%

 ）CHO ≤0.05%

宿主细胞DNA含量（见药典附录ⅨB）

1、样品：原液、成品

2、方法：

 点印迹杂交法，地高辛标记

 标准品：厂家提供

3、标准： 含量≤10ng/剂量

细菌内毒素含量（见药典附录ⅫE凝胶限量实验）

1、样品：原液、成品

2、方法：

 鲎试剂分析法

　　鲎试剂标准品：中检所提供

3、标准：

 内毒素含量≤1０ＥＵ/剂量

（二）工艺相关杂质（见药典附录ⅨA）

          如残余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清

（三）产品相关杂质

          如多聚体、不同的PEG修饰产物

六、安全性及其它检测项目

（一）无菌试验

          平皿法，需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体

（二）热原试验

           鲎试剂法或家兔法

（三）异常毒性试验

           小鼠（1ml)或豚鼠（5ml），腹腔注射

（四）水分、装量、pH值

原液质量标准

⏹生物学活性、比活性（见药典附录ⅩC）

⏹蛋白质含量(见药典附录ⅥD)

⏹纯度：≧95%，非还原SDS-PAGE法（见药典附录ⅣC）、HPLC法（见药典附录ⅢB）

⏹分子量：还原型SDS-PAGE法（见药典附录ⅣC）、质谱法

⏹外源性DNA残留量： ≤10ng/剂量（见药典附录ⅨB）

⏹宿主蛋白残留量:   ≦0.1%，0.05%（见药典附录ⅨC）

⏹残余抗生素：不得检出（见药典附录ⅨA）

⏹细菌内毒素：≤10EU/剂量（见药典附录ⅫE凝胶限量实验）

⏹结构确证：等电点（见药典附录ⅣD）、紫外吸收光谱扫描（见药典附录ⅡA）、N末端15个氨基酸顺序、肽图（见药典附录ⅧE）、（氨基酸组成、）

成品质量标准

⏹鉴别试验：免疫印迹法/斑点法，阳性

⏹物理检查：外观、可见异物、装量

⏹化学检定：水分、pH值

⏹生物学活性：标示量的%范围

⏹无菌检查：不得检出

⏹内毒素检查： ≤10EU/剂量

⏹异常毒性检查：符合规定

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