过氧化氢的测定方法

[原理] H202在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

[仪器与用具] 紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶250ml1个；刻度吸管0.5ml2支；2ml1支；10ml试管3支；恒温水浴锅。

[试剂] 0.2mol?L-1pH7．8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；0．1mol?L-1H202(用0．1mol?L-1高锰酸钾标定)。

[方法]

1．酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其他植物组织0．5g，置研钵中，加入2-3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000r.min-1下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。

2．测定 取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表42-2顺序加入试剂。 25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2，每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按式42-3计算酶活性。

3．结果计算 以1min内A240减少0．1的酶量为1个酶活单位(u)。

过氧化氢酶的活性（u.g-1min-1）=

式中 Aso--加入煮死酶液的对照管吸光值；

As1,As2-样品管吸光值；

Vt--粗酶提取液总体积(ml);

V1--测定用粗酶液体积(ml);

FW--样品鲜重(g); 0．1-A20每下降0．1为1个酶活单位(u);

t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

注意:凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

【思考题】

1、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?

2、过氧化氢酶与哪些生化过程有关?

参考文献 【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170

【2】蒋明义，郭绍刚，渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12

【3】林植芳，李双顺等.衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系，植物生理学报.1998,14(1):16-22

【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京：中国农业出版社，1995

【5】【美】吉尔鲍特GG.缪辉南，陈石根等译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1982

实验材料：小白菜

注意事项：

1、 三角瓶、容量瓶等务必要清洗干净。

2、 研磨时CaCO3不要加得太多，大半匙即可，且要洒均匀。

3、 过滤时不必全部过滤完，有20ml滤液即可。

4、 把握好实验进度，不拖延时间，以免酶液失活。

5、 滴定时速度不要过快，以免过量（最快不要超过1秒/滴）。最佳终点为

最后半滴加入后蓝色消失。

6、 每次滴定起点一致，都从零开始。

7、 左手操纵活塞，右手摇三角瓶，溶液要摇成漩涡状。

8、为了保证实验的平行性，四个三角瓶里所加的试剂应该来自同组药品，中途不要试剂瓶（使用别组药品）。

结果分析：

但本实验的不确定因素很多，比如气温高低、样品差异、试剂新旧，因此较难达到老师的水平。

结果偏低的主要原因：1、实验时间过长，酶液失活；2、器皿未洗干净，残存酸或碱，酶活性下降；3、样品滴定过量。

结果偏高的主要原因：1、空白样滴定过量。

小知识：

1、 加入过氧化氢之前为什么要保温平衡？

答：为了使三角瓶中的溶液温度达到过氧化氢酶的最适酶促反应温度。过氧化氢酶的酶促反应最适温度为20－25℃，受实验室条件，如果室温在这个范围内则不进行水浴，在空气中保温。

2、 为什么有个别组在加入KI溶液后有黑色沉淀出现？

答：因为KI溶液放置时间过长易被空气中的氧气所氧化，出现单质I2，这样再加上被过氧化氢所氧化而得的I2，就可能在三角瓶中出现单质I2过饱和，从而析出变成沉淀。遇到这种情况应该更换KI溶液重做。

3、为什么不能用NaOH代替H2SO4终止酶活性？

答：H2SO4除了利用强酸性终止酶活外还参与氧化还原反应，参与KI生成I2的氧化还原反应; NaOH虽然有强碱性可以终止酶活，但不能参这个反应，这样无法测出过氧化氢的量。

【转帖】过氧化氢酶活性的测定方法

过氧化氢酶

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：pH值范围4-9,而以7.0,37℃最适。冷冻、冻干、阳光、氧气降酶活。用Beers&Sizers法（改进型）测定。见[德]B 施特尔马赫著，钱嘉渊译 酶的测定方法 p186-188。

1.试剂：

(1)1N氢氧化钠溶液：称2g，用蒸馏水定容至50ml。

(2)磷酸盐缓冲液（pH7.0）：取0.68g磷酸二氢钾，溶于75ml蒸馏水，用1N氢氧化钠溶液将pH调至7.0，定容至100ml。

(3)底物溶液：现配。用磷酸盐缓冲液把0.6ml过氧化氢（30％的H2O2）稀释至100ml。

(4)酶液浓度应为5-20u/ml。

2.操作：

用移液管将1.0ml底物溶液和1.9ml蒸馏水滴入一只1厘米比色皿，并调水温至25℃。为检查在不加酶的情况下吸光度是否也降低，在240nm处以蒸馏水为参比测定吸光度，若吸光度的降低幅度超过0.01，则在计算主值时须减去此值。取另一比色皿，加入上述溶液，并加0.10酶溶液，在240nm处以蒸馏水为参比在连续5分钟内测定吸光度（每隔1分钟读取一次结果，直至每分钟吸光度的降低值达到稳定为止）。

3.计算：在上述条件下，每分钟酶促分解1umol过氧化氢的酶量定为1个酶活力单位。

U/mg = E240×

3 / 0.0436×Ew

式中：E240—240nm处每分钟内吸光度的降低值

Ew—每0.10ml所用酶液中含酶的重量（mg）

0.0436—240nm处1umol过氧化氢的吸光度

3—反应混合液的总体积。

5] 波钦诺克 X H 著.植物生物化学分析方法.荆家海，丁钏荣译.北京:科学出版社，1981.205～207

参考文献

【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170

【2】蒋明义，郭绍刚，渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12

【3】林植芳，李双顺等.衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系，植物生理学报.1998,14(1):16-22

【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京：中国农业出版社，1995

【5】【美】吉尔鲍特GG.缪辉南，陈石根等译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1982

三、过氧化氢酶的活性----紫外吸收法

[原理]

　　H2O2在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

[仪器与用具]

　　紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶250ml1个；刻度吸管0.5ml2支；2ml1支；10ml试管3支；恒温水浴锅。

[试剂]

　　0.2mol·L-1pH7．8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；

　　0．1mol·L-1H2O2(用0．1mol·L-1高锰酸钾标定)。

[方法]

　　1．酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其他植物组织0．5g，置研钵中，加入2—3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000r.min-1下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。

　　2．测定 取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表42—2顺序

　　加入试剂。

　　表 42-2 紫外吸收传测H2O2样品测定液配制表

管 号 S1 S2 S3

粗酶液(mI)

PH7.8磷酸(ml)

蒸馏水(ml)

0.2 0.2 0.2

1.5 1.5 1.5

1.0 1.0 1.0

　　25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2，每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按式42-3计算酶活性。

　　3．结果计算 以1min内A240减少0．1的酶量为1个酶活单位(u)。

　　　　过氧化氢酶的活性（u.g-1min-1）= (42-3)

　　　　式中

　　　　Aso——加入煮死酶液的对照管吸光值；

　　　　As1,As2—样品管吸光值；

　　　　Vt——粗酶提取液总体积(ml)

　　　　V1——测定用粗酶液体积(ml)

　　　　FW——样品鲜重(g)

　　　　0．

1—A20每下降0．1为1个酶活单位(u)

　　　　t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

[注意]

　　凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。