PCR实验中的几点体会

PCR实验是一项对仪器设备、环境设施及操作步骤要求非常严格的实验，实验过程中检测目的成份会被扩增放大到千百万倍。因而实验过程中很小的一点误差、非常微量的污染都可能导致结果错误甚至实验失败。我们在实际工作中，从环境控制到仪器维护及工作流程的每一步做到严格要求细致入微，样本检测、室内质控及室间质评都取得了满意成绩，在此次PCR实验室复审中得到专家老师的肯定，现将我们在工作中认为需地注意的地方提出来，以供商榷：

一、环境控制  为控制温度而使用空调时必须特别注意避免污染。我们的做法是清洁空调过滤网，待干，紫外线消毒30分钟，正反面相同。开机之前用1：100“84”消毒液浸湿的纱布包住出风口，运行30分钟，使吸附空调机内的灰尘。

二、试剂配制  

所有的试剂都尽可能平衡到室温后再使用。HBV-DNA检测中的浓缩液及质控物， 融化后定量分装离心管中，一次用不完的冻存到下次使用，避免反复冻融。

三、样本制备  

吸取上清液  吸头不要接触到离心管内壁，尽量在离心管，悬停在液面下随液面下降而逐渐下移，尽量吸净上清液。

沉淀处理    HBV-DNA浓缩过程中的沉淀，用振荡器很难完全分散也可能影响核酸的提取，导致测定结果偏低。我们的做法是用一只小镊子轻敲离心管底部使沉淀尽可能分散，充分混匀，然后点离一下。

提取  提取液是一种混悬液，易沉淀，加取过程中要不断抽吸混匀。

加样  核酸的提取液2ul加入反应管中，这一步移液器使用非常关键。首先保证移液器和吸头是配套的，再就是吸头是垂直于液面吸取样本，移液时用力要均匀，尽可能一次性移出全部样本。2ul移液器校正困难，当标准曲线线性关系不好时，可以考虑是否是移液器使用时间过久，应该及时更换。

四、扩增分析  扩增仪最好先预热一下，再使用。扩增开始后应注意观察温度曲线。不符合温度变化规律的曲线如升温曲线变得平坦提示仪器部分或全部加热模块功能损坏，从而导致结果错误。在结果判定时应注意分析扩增曲线，曲线出现倒“S”形，常提示病毒含量较高，必须稀释后复查。