酵母培养实验

一、实验目的

掌握酵母培养与酒精发酵的基本原理和操作方法，了解影响酵母培养与酒精补料分批发酵的主要因素。

二、实验原理

本实验综合运用生物工艺学课程中所学的基本原理和发酵方法，对淀粉质原料酒精发酵过程进行全程监测，模拟工业生产上的整个过程，因此是一个综合性很强的实验。要求学生较灵活地运用基本知识，解决实验过程中出现的问题，并在实验后系统总结获得全面提高。

麦芽中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，通常包括蒸煮（液化）、糖化等处理。蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，目前多数厂家开始利用α-淀粉酶的液化作用来替代蒸煮过程，这样可大大减少能源消耗。液化后的醪液能更好地接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进行酒精发酵。　　α-淀粉酶，又称为1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，广泛存在于动、植物和微生物体中，如麦芽或动物的唾液、脾脏中均含有较多的α-淀粉酶，而当今α-淀粉酶的工业化生产也主要是利用微生物工程菌进行生产的。α-淀粉酶容易溶解于水和较稀的缓冲液中，它能够切断淀粉分子中的α-1，4糖苷键，生成糊精及少量麦芽糖或葡萄糖，从而使淀粉遇碘变蓝的特异性颜色反应逐渐消失，由此颜色反应消失的速度即可测出该酶的活性。

工艺流程如下：麦芽→加水拌料→液化→糖化→发酵→蒸馏→酒精 

                                           ↑

                                         一级种子

                                           ↑

耐高温酒精活性干酵母→活化

发酵醪中酒精含量的测定方法很多，如常规蒸馏法、碘量滴定法、比色法及改良康维法等，本实验采用第一种方法。

三、器材与材料

1、酵母菌种，使用前必须活化。

2、12oBx麦芽汁培养基

3、麦芽汁（见麦芽汁处理），生化培养箱，摇床，离心机，分光光度计，糖份、酒精测定试剂及装置。

四、实验步骤及方法

1、培养基准备

麦芽汁培养基：将干麦芽粉，以200g麦芽加700ml去离子水，加入1g中温α-淀粉酶，在65℃水浴锅中处理3-4h，糖化程度可用碘滴定。将糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒入糖化液中搅拌煮沸后再过滤。将滤液调节至pH约6.4。每组分装后于121℃，15min，灭菌备用。

2、酵母活化

3%酵母粉（7.5g），2%葡萄糖（5g），溶解于250ml去离子水中。在35℃复水20min，降温至32℃培养2h。

3、一级种子培养

250mL三角瓶，12oBx麦芽汁培养基，装液量50mL；接活化液约4mL，30℃，150rpm/min摇瓶培养6-8h。细胞浓度达1.5×108个/mL以上，无杂菌，无死细胞。

采用血球计数法进行细菌形态观察和活菌计数，并记录实验结果。在无菌操作台取培养液0.5ml，加入2滴0.05%美蓝染色液，置于装有4.5ml无菌生理盐水的试管中摇匀。无菌操作用移液管滴取菌液于血球计数板，放置3分钟后用显微镜观察计数，并且计算出芽率。详见《微生物学实验P54》。

4、乙醇发酵

①接种：按8%接种量将一级种子分别接入至2只装有100ml麦芽汁培养基的三角瓶中静止培养。其中，一瓶用于测定发酵参数，一瓶始终置于培养箱中培养。

②补糖：发酵前期，接种4h后补加5%葡萄糖0.2ml，以后每2h补加5%葡萄糖0.2ml至对数生长期后期（具体时间根据菌体生长而定）。

发酵中后期，每4h可加入5%左右的葡萄糖2ml。

③温度：发酵前期30℃，发酵中后期34℃。

④细胞浓度：发酵前期，接种2小时后每小时测定一次细胞浓度至稳定期后，再间隔2小时测一次细胞浓度。用血球记数板法测量菌体量及出芽率，并绘制生长曲线。

⑤湿菌体量的计算：发酵结束，离心后，用无菌水洗涤2次，称量湿菌体重。

5、蒸馏,测酒精度

五、实验数据处理

(1)根据实验过程的检测和记录数据，绘制生长曲线。

(2)湿菌体重

(3)酒精度

实验分组及详细安排

以3-4人为一组。周一和周二模块3同学分为7组进行培养基和一级种子制备等基础工作，模块1同学进行遗传学实验。周三以后全体同学共同进行酒精发酵实验，共分为18组，其中模块1分为11组，模块3分为7组。在周一和周二模块3同学也需要配制模块1同学实验所需培养基、试剂、一级种子液等。以下列出每天每组的各实验器材及药品准备量。

周一上午：分发实验资料，老师讲解。

（1）配制麦芽汁培养基（1个250ml三角瓶装液量为50 ml，其余数个（模块3第1-5组6个，6组和7组4个）250ml三角瓶装液量为100 ml，灭菌待用）。

（2）同时，每组准备好如下器材：

① 250ml三角瓶（模块3第1-5组准备7个，6组和7组准备5个）；② 1L烧杯（模块3每组准备1个）；③ 1块血球计数板；④ 1个盖玻片；⑤ 1台显微镜；⑥ 5ml移液管8只，⑦ 10ml移液管3只；⑧ 0.5ml移液管6-7只；⑨ 试管30只；⑩ 离心管2只。

周一下午：

（1）干热灭菌：5ml移液管8只，10ml移液管3只，其中5ml移液管和10ml移液管使用时模块1和模块3共18组平分，0.5ml移液管6-7只，试管30只，轮换使用。离心管2支。灭菌待用。

（2）酵母活化：以班级为单位制备，由第6组同学完成。3%酵母粉（7.5g），2%葡萄糖（5g），溶解于250ml去离子水中。在35℃复水20min，降温至32℃培养2h。然后置于冰箱冷藏。

（3）5%葡萄糖溶液：以班级为单位制备，由第7组同学完成。配制5%的葡萄糖液300ml，分3瓶分别置于3只100ml三角瓶中。与麦芽汁培养基一起湿热灭菌。

   （4）生理盐水：以班级为单位制备，由第5组同学完成。9g NaCl用去离子水定容至1 L，分装与试剂瓶中。每组将生理盐水分装于30只试管中，每管4.5ml，包扎，与麦芽汁培养基一起湿热灭菌待用。余下未灭菌的生理盐水置于试剂瓶中，室温储藏备用。

周二：种子培养。250mL三角瓶，12oBx麦芽汁培养基，装液量50mL；接活化液约4mL，30℃，150rpm/min摇瓶培养6-8h。细胞浓度达1.5×108个/mL以上，无杂菌，无死细胞。培养至2h后开始取样，以后每小时用血球计数板测定一次细胞量和出芽率。直至对数生长期后期培养结束，将种子液取出置于室温下储藏备用。实验报告要求计算细胞浓度并绘制生长曲线。

    需及时灭菌生理盐水、移液管等物品。

周三：酒精发酵。早6:30需同学先来开紫外灯，7:00所有同学必须到。模块3同学直接接种。模块1同学先在实验室听老师讲解实验内容，而后接种。按8%接种量将一级种子分别接入至2只装有100ml麦芽汁培养基的三角瓶中静止培养。其中，一瓶用于测定发酵参数，一瓶始终置于培养箱中培养。（模块3第6、7两组都接种3瓶，多接的一瓶用于做对照实验）

发酵前期，接种4h后补加5%葡萄糖0.2ml，以后每2h补加5%葡萄糖0.2ml至对数生长期后期（具体时间根据菌体生长而定，2瓶都需补糖，但只有一瓶用于测生长曲线）。其中，模块3第6、7两组同时做发酵前期不补糖，发酵中后期照常补糖的对照。对照需测定生长曲线。

通过显微镜计数观测到对数生长期后期时即补料5%左右的葡萄糖2ml，以促进酒精生产，并将培养温度升高至34℃。以后每2h可加入5%左右的葡萄糖2ml至发酵结束。

生长曲线的绘制：培养至2h后开始取样，以后每小时用血球计数板测定一次细胞量和出芽率。直至稳定期。至稳定期后，再间隔2小时测一次细胞浓度。以培养时间为横坐标，每毫升菌液所含细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

实际实验时间根据情况而定。

周四：离心，取上清液。测酒精度。

本实验前请复习以下内容：微生物学实验教材中实验3、4、5、12.老师讲解时会随机提问。

实验时请带以下物品：微生物学实验教材；实验讲义；实验数据记录纸；实验报告。

生物106实验报告请于12月10日前交至28-204.