重组人表皮生长因子外用溶液(I)

Chongzu Ren Biaopi Shengzhangyinzi Waiyong rongye(Ⅰ)

Recombinant Human Epidermal Growth Factor Derivative for External Use，Liquid

本品系由高效表达人表皮生长因子衍生物基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。

1基本要求

生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2制造

2.1工程菌菌种

2.1.1名称及来源

重组人表皮生长因子衍生物工程菌株系由带有人工合成人表皮生长因子衍生物基因（较天然人表皮生长因子5′N端多3个氨基酸序列：Ala-Arg-Ile）的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。

2.1.2种子批的建立

应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。

2.1.3菌种检定

主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。

2.1.3.1划种LB琼脂平板

应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。

2.1.3.2染色镜检

应为典型的革兰阴性杆菌。

2.1.3.3对抗生素的抗性

应与原始菌种相符。

2.1.3.4电镜检查（工作种子批可免做）

应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

2.1.3.5生化反应

应符合大肠杆菌生物学性状。

2.1.3.6人表皮生长因子衍生物表达量

在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量（10%）。

2.1.3.7质粒检查

该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。

2.1.3.8目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）

目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。

2.2原液

2.2.1种子液制备

将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适宜抗生素）中培养，供发酵罐接种用。

2.2.2发酵用培养基

采用适宜的不含任何抗生素的培养基。

2.2.3种子液接种及发酵培养

2.2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。

2.2.3.2在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录Ⅸ G）。

2.2.4发酵液处理

用适宜的方法收集处理菌体。收集的菌体原则上应立即进行初步纯化，必要时可在-20℃冻存，并规定贮存期。

2.2.5纯化

采用经批准的纯化工艺进行初步纯化和高度纯化，使其达到3.1项要求，即为人表皮生长因子衍生物原液。加入稳定剂，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。

2.2.6原液检定

按3.1项进行。

2.3半成品

2.3.1配制与除菌

2.3.1.1稀释液配制

按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。

2.3.1.2稀释与除菌

将检定合格加稳定剂的人表皮生长因子衍生物原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。除菌过滤后即为半成品，保存于2～8℃。

2.3.2半成品检定

按3.2项进行。

2.4成品

2.4.1分批

应符合“生物制品分批规程”规定。

2.4.2分装

应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。

2.4.3规格

应为经批准的规格。

2.4.4包装

应符合“生物制品包装规程”规定。

3检定

3.1原液检定

3.1.1生物学活性

依法测定（附录Ⅹ H）。

3.1.2蛋白质含量

依法测定（附录Ⅵ B第二法）。

3.1.3比活性

为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于5.0×105IU。

3.1.4纯度

3.1.4.1电泳法

依法测定（附录Ⅳ C）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为17.5%，加样量应不低于10μg(考马斯亮蓝R250染色法)或 5μg(银染法)。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。

3.1.4.2高效液相色谱法

依法测定（附录Ⅲ B）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相(三氟乙酸-水溶液：取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀)、B相(三氟乙酸-乙腈溶液：取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀) 为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱(0～70％B相)。上样量不低于10μg，于波长280nm处检测，以人表皮生长因子衍生物色谱峰计算理论板数应不低于500。按面积归一化法计算，人表皮生长因子衍生物主峰面积应不低于总面积的95.0%。

3.1.5分子量

依法测定（附录Ⅳ C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为17.5%，加样量应不低于1.0μg。分子质量用重组人表皮生长因子衍生物对照品校正后应为6.2kD±0.62kD。

3.1.6外源性DNA残留量

每1支次人用剂量应不高于10ng（附录Ⅸ B）。

3.1.7等电点

主区带应为4.1～5.1, 供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致。（附录Ⅳ D）。

3.1.8紫外光谱扫描

用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波长230nm～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为 276nm±3nm（附录Ⅱ A）。

3.1.9肽图（至少每年测定1次）

依法测定（附录Ⅷ E），应与对照品图形一致。

3.1.10 N-末端氨基酸序列（至少每年测定一次）

用氨基酸序列分析仪测定，其N-末端序列应为：

(Met)-Ala-Arg-Ile-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly。

3.1.11鉴别试验

按免疫印迹法（附录Ⅷ A）或免疫斑点法（附录Ⅷ B）测定，应为阳性。

3.1.12残余抗生素活性

依法测定（附录Ⅸ A），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。

3.2半成品检定

无菌检查

依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。

3.3成品检定

3.3.1鉴别试验

按免疫印迹法（附录Ⅷ A）或免疫斑点法（附录Ⅷ B）测定，应为阳性。

3.3.2物理检查

3.3．2．1外观

应为无色无臭澄明液体，不得含有肉眼可见的不溶物。

3．3．2．2装量

依法检查（附录Ⅴ F），应符合规定。

3．3．3pH值

应为6.5～7.5（附录Ⅴ A）。

3．3．4生物学活性

应为标示量的70%～200%（附录Ⅹ H）。

3．3．5无菌检查

依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。

4保存、运输及有效期

于2～8℃避光保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。

5使用说明

应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。