微核检测技术

一、实验目的

    了解微核测试原理和毒理遗传学意义。学习蚕豆根尖的微核测试技术。

2、实验原理

    微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在过程中行动滞后，在末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。

  已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。

3、材料、仪器与试剂

1、材料：蚕豆根尖

2、仪器：10W紫外灯、显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、滤纸

3、试剂：卡诺固定液（95%酒精：冰醋酸=3:1）、70%乙醇、卡包品红染色剂、1.0mol/LCrO3、0.5mol/LNaN3、150mol/LEMS溶液、6mol/L盐酸。

4、实验步骤

1、浸种催芽（按讲义上的步骤）

2、根尖染毒处理

2.1 紫外光处理：取出五组蚕豆根尖，分别用10W紫外灯等距离照射，分别照射0min、15min、25min、35min、45min，制片观察微核数目。

2.2 诱变物处理：取出三组蚕豆根尖，分别放入盛有1.0mol/LCrO3、0.5mol/LNaN3、150mol/LEMS溶液的培养皿中，皿中溶液浸没根尖即可。分别处理根尖24h。诱变处理后，用蒸馏水冲洗根尖表面的溶液。

3、根尖细胞的恢复培养

洗净后置于铺有浸润滤纸的瓷盘中，25℃下再恢复培养22h。

4、根尖细胞的固定

将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根，用（甲醇：冰醋酸=3:1）液固定24h。固定后的根如不及时制片，可换入70%的乙醇溶液中置4℃冰箱中保存备用。

5、酸解

用蒸馏水浸洗固定好的幼根2次，每次5min，吸净蒸馏水，加入6mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10min，幼根软化即可。

6、染色

 吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根3次，每次2min，最后浸于水中。制片前置于载玻片上，截取前端1~2mm左右长的淡黄色部分（生长点），用另一块载玻片与前者交叉成十字形压片，将材料压成薄层。揭片后，两块载玻片的中间部分都占有相似的薄层，将其中一块用少量蒸馏水冲到另一块上，滴1~2滴卡包品红染色剂，用镊子将生长点捣碎，染色10min，将染液吸净后，滴加蒸馏水，小心加上盖玻片，注意防止气泡产生。然后覆盖吸水纸，用大拇指按压，使染色区呈云雾状。

7、镜检

每个根尖数1000个左右细胞，观察并统计其中含微核的细胞数。

5、数据分析

计算各测试样品的微核千分率（MCN‰)

MCN‰=（某测试样品观察到的微核数/某测试样品中观察到的细胞数）×1000‰

备注：卡宝品红染色剂就是石炭酸品红，

配制方法：

先配成三种原液,再配成染色液

原液A:3 g碱性品红溶于100 ml 70%酒精中.

原液B:取原液A 10 ml加入到90 ml 5%石炭酸水溶液中.

原液C:.取原液B 55 ml,加入6 ml 冰醋酸和6 ml(38%的甲醛).

(原液A和原液C可长期保存,原液B限两周内使用).

染色液:取C液10—20 m1,加45%冰醋酸80～90 ml,再加山梨醇1.8 g,配成10%～20%浓度的石炭酸品红液,放置两周后使用,效果显著(若立即用,则着色能力差).

适用范围:适用于植物组织压片法和涂片法,染色体着色深,保存性好,使用2—3年不变质.山梨醇为助渗剂,兼有稳定染色液的作用,假如没有山梨醇也能染色,但效果较差.