基因工程 第六章 转基因动物

转基因动物是指用DNA重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，使外源目的基因随细胞的而增殖并在体内表达，且能稳定地遗传给后代的动物。

    1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的“超级小鼠”。

    按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙、鱼等。

第一节  动物转基因技术

转基因动物的关键技术包括：

1.外源目的基因的分离

2.外源目的基因与转性基因表达启动子、增强子、报告基因等构件的拼接重组

3.重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞

4.胚胎移植技术

5.鉴定及筛选

6.目的基因整合率及表达效率的检测

一、显微注射法

1.目的基因的制备

2.小鼠的准备和要求

3.受精卵的分离

4.显微注射

5.受精卵的移植

6.转基因小鼠的鉴定

二、逆转录病毒法 

1．原理：

    逆转录病毒的核酸为一条单链RNA分子，其基因由两部分组成，一是顺式作用序列，为病毒复制和整合所必需；二是反式作用序列，编码病毒的包装蛋白。将外源基因取代反式作用序列构建成重组载DNA。

     另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之整合到染色体上，形成包装细胞。

    如果重组病毒DNA导入这种包装细胞中，病毒包装蛋白能将DNA包装成具有感染力的重组蛋白颗粒，能浸染动物细胞而将重组DNA引入宿主细胞。

2．步骤：

1.逆转录病毒载体的构建

2.选择和培养包装细胞系

3.重组病毒DNA导入包装细胞

4.收集重组病毒颗粒

5.感染胚细胞，使细胞转化

此法是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法。

三、胚胎干细胞法

胚胎干细胞是在人（哺乳动物）胚胎发育早期——囊胚（受精后约5—7天）中未分化的细胞。囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步、分化，发育成个体。 

    由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。

1．利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠的过程

（1）3.5天的孕鼠

（2）分离胚细胞

（3）转入培养皿中培养

（4）分离内层细胞团

（5）收集干细胞克隆

（6）酶处理解散细胞

（7）培养干细胞

（8）转染干细胞

（9）植入母鼠体内

2．在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术

2007年诺贝尔生理学或医学奖分别授予两名美国人马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯和一名英国人马丁·埃文斯，以表彰他们在“基因靶向”技术方面的突出贡献。诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，三位科学家“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物ＤＮＡ重组方面有着一系列突破性发现”，为“基因靶向”技术的发展奠定了基础。在“基因靶向”技术的帮助下，科学家可以使小鼠体内的特定基因丧失功能。此类“基因敲除”试验可以帮助人们了解基因在胚胎发育等多种现象中发挥何种作用。“基因靶向”技术为阐明人类疾病的发生机理方面发挥了至关重要的作用 。

基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。 

    基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。 通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。

四、精子载体法

精子载体法是精子和外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。

    外源DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。

五、体细胞核移植法

1997年，英国科学家Schnieke和Wilmut等通过体细胞核移植技术成功克隆了“多莉”。

     1997年6月Wilmut报道用胚胎细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆绵羊“波莉”。

     1999年，美国科学家Alexander克隆了３头山羊，改变了它们的基因性状，使它们的乳液内含有一种对心脏病具有疗效作用的蛋白质。 

六、受体介导法

是将外源DNA与受体分子连接后与胚胎细胞共培养，受体可以介导外源DNA进入受体细胞，从而实现基因转移。

   1999年，Ivanava用受体介导法制作了转基因鼠。

第二节  提高转基因效率的策略

1、对外源基因的整合机制进行深入研究，避免基因的随机整合，提高基因的表达效率。

2、建立更完善的转基因方法。利用胚胎干细胞介导可以进行基因表达的体外选择，是提高转基因效率的有效方法。

3.探索有效的阳性胚胎筛选方法。

4.使用大的外源DNA片段。

5.选择表达效率高的启动子。

6.其它DNA顺序的影响。如顺式区元件等。

第三节  转基因动物的应用

一、转基因动物在基因功能等生命科学基础研究中的应用

转基因是研究特异性基因表达机制和基因的生物学功能的有效工具。

主要通过：

（1）将这一基因在受体动物中过渡表达。

（2）将这一基因从动物基因组中剔除，即：基因剔除技术。

二、转基因技术在动物育种中的应用

1、提高动物的抗病能力

2、提高动物生长速度

3、提高动物产毛能力

4、改善乳品品质

5、提高动物生存能力

三、转基因动物在医药科学研究中的应用

1、生产用于人体器官移植的动物器官

2、在药理学方面的应用

3、作为人类疾病模型

4、作为生物反应器的应用

第四节 转基因动物研究中存在的问题及展望

一、转基因动物成功率低

二、造成宿主基因突变问题

三、外源基因表达水平不高问题

四、逆转录病毒转染法研究中存在的问题

五、安全性问题