实验八-1酸性磷酸酯酶的提取

掌握胞内酶的分离提取方法，学会离心机的使用。

实验原理

酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，E．C．3．1．3．2．）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：

由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验所采用的是Folin-酚法。

本实验以绿豆芽为材料，将其细胞破碎，释放出酸性磷酸酯酶，离心除去细胞碎片和植物纤维等杂质，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，为下面的酶学性质研究及SDS-PAGE电泳法测相对分子质量等系列生物化学实验做准备。

　 实验操作

1.匀浆：参见图8-1-1～图8-1-3，戴上手套，将绿豆芽掐去根和叶，称取50g的绿豆芽茎，在碾钵中用碾锤彻底捣碎，室温静置0.5h，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。

2.平衡：参见图8-1-4，将2只100mL烧杯分别放到托盘天平的2只托盘上进行平衡。将滤液倒入2只离心管中，再把离心管连同其盖子分别放入托盘上的2只烧杯中，用滴管增、减离心管中的溶液使其在托盘天平上进行平衡，平衡后盖上离心管的盖子，用记号笔做好标记。

图8-1-4 离心管的平衡

3.离心：参见图8-1-5～图8-1-8，按住离心机右侧面上方的按钮，即可掀开离心机的盖子，再旋开转子的盖子，将平衡好的2只离心管插入离心机转子的2个相对的槽中（这是为了保护离心机），等2组或3组同学都插好了以后（即转子中的4个或6个槽均插上了离心管），旋上转子的盖子，再合上离心机的盖子，在离心机面板上将“定时”旋钮调到21min，将“转速”旋钮调到最大，插上电源插头，开启“电源”开关，按下“启动”按钮。此时，离心机开始加速旋转，当转速指针接近4000rpm时，将“转速”旋钮回调至中间附近的位置（12点钟位置），转速便会恒定在4000rpm。离心20min后，离心机会自动减速。必须等到转速指针指示为“0”时，即转子彻底停止了旋转，才能开盖取离心管。

4.保存：将离心管中大部分上清液倒入量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后倒入三角烧瓶中，做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“

原酶液”在冰箱中保存备用。

5.洗净所有用过的玻璃仪器、碾钵和离心管，收拾干净桌面，请老师检查。

计算

上清液体积（mL）

粗酶液得率（mL/g）＝上清液体积/绿豆芽茎重量