镍琼脂糖凝胶柱的制备

----来自李洋师姐

2.3.1.1 螯合琼脂糖装填

用水清洗柱子，并装满水后使之自然流出。5ml 0.1mol/L HCl洗一次， H2O洗一次，再用5ml 0.1mol/L NaOH洗一次， 并用H2O再洗一次。尔后用75%乙醇洗一次，再用H2O洗一次。在一块厚纸板打孔，将柱子插进去固定使之垂直。再用夹子将纸板夹住并固定在铁支架上，让柱子保持垂直向下。加入蒸馏水，随后用帽盖堵住下端出口。柱内保留大于2/3体积的蒸馏水。将琼脂糖凝胶溶液搅匀，用塑料短吸管将琼脂糖凝胶溶液加入柱子的水溶液中，让其自由扩散下沉，打开下端出口让溶液自由流出，同时不断地在上面加入琼脂糖凝胶溶液,至到柱体积达到6ml为止。用2-5倍柱床体积的蒸馏水洗柱子。柱子装好后将上下两端帽盖盖好备用。

2.3.1.2 螯合金属离子

将1.577g NiSO4.6H2O溶解在蒸馏水中，浓度为0.2 mol/L，过滤后备用。将装好的柱子上下两端帽盖打开，让溶液自由流出。待上端溶液快接近凝胶基质表面时，用小吸管将 0.2 mol/L NiSO4溶液靠柱壁边缘加入，溶液进去的速度要大于流出的速度，直到上完5个柱床体积的金属离子溶液。待0.2mol/L NiSO4溶液快接近凝胶基质表面时，用相同的办法加入不应少于5倍柱床体积的ddH2O洗柱。

2.3.2 平衡、结合和洗柱

用10倍柱床体积的PBS*(pH7.4）缓冲溶液平衡柱子。流速控制在1mL/min至1.2mL/min。当柱中平衡溶液快接近凝胶柱界面时，封住下端出口，取出螯合好的填料与80 mL蛋白样品在4度旋转混匀2h，8000rpm/min 4℃离心10min，转移全部上清，加入10倍柱体积的平衡缓冲液混匀填料，继续在4度旋转混匀30分钟，将结合后的填料再次上柱，操作同前。

2.3.3 分步梯度洗脱

（1）分别用5倍柱体积的I-40*和2倍柱体积的I-45 Buffer*洗脱，流速为自然流出，收集洗脱液。每次洗脱时，用1.5ml Eppendorf 管收集，每管收集1.5 ml。这一步用来除去与镍非特异性结合的杂蛋白。

（2）用I-250 Buffer洗脱，流速为自然流出，收集洗脱液。收集方法与上相同。目的蛋白在这一步从柱上被洗脱下来。

（3）最后用I-1000 Buffer 洗脱，流速为自然流出，不必收集洗脱液，因为这一部与蛋白的纯化无关，通常是为了清洁镍柱。

2.3.4 蛋白检测

用分光光度计检测收集的每管的OD280 ，确定哪些管中有蛋白以及蛋白在洗脱液中的分布情况。从第1管到最后一管的OD280 值呈现一个曲线分布，取曲线峰两边的对应管中蛋白跑Native-PAGE，进行活性染色以确定目的蛋白所在管号。找到目的蛋白后，再跑SDS-PAGE确定蛋白质的纯度。根据跑胶的结果估测邻近管里蛋白的纯度，最后将纯的目的蛋白收集在一起。

2.3.5 用过的Ni柱后处理

先用2倍柱床体积2mol/L NaCl水溶液洗柱子以除去因离子交换作用吸附的蛋白，并用2倍柱床体积蒸馏水洗一次。再用10倍柱床体积0.5 mol/L NaOH溶液洗柱子，并用蒸馏水洗至流出液为中性。最后用4倍柱床体积的70%的乙醇洗柱子。洗干净的镍柱可在20%乙醇中4℃保存。

2.3.6 重新恢复Ni2+离子柱

一般柱子使用了6-8次后需要重新恢复Ni2+离子柱。用过的柱子先按照3.7中步骤处理,然后用一倍体积的0.5 mol/L EDTA将所有柱上的Ni2+离子洗下来,再用10-20倍体积的水洗柱,除去任何残留的EDTA。最后按3.1.b的步骤重新让Ni2+离子结后到柱上备用。

I-40 Buffer： 40mM Imidazole in PBS Buffer

I-45 Buffer： 45 mM Imidazole in PBS Buffer

I-250Buffer： 250mM Imidazole in PBS Buffer

I-1000Buffer：1 M Imidazole in PBS Buffer