土壤微生物的分离和纯化

一、实验目的

1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。

2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。

3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。

二、实验原理

土壤是微生物生长和栖息的良好基地。土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于培养细菌。 链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。

三、实验器材

1、材料：10cm左右深层土壤。

2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基

3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液、头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚 、无菌水。

四、实验步骤

1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。

2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释10－2的土壤悬液。然后进行十倍梯度稀释，依次制备 10－3、10－4、10－5、10－6 、10－7 稀释度的土壤稀释液。                                                                  

3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。灭菌后分别倒3个平板。（高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素）

4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。细菌选用10－4、10－5、10－6 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2  、10－3、10－4 三个稀释度，分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。（一个稀释度一个平板）

5、培养：细菌平板于37℃恒温培养1～2d，放线菌于30℃培养2～3d，霉菌于30℃培养3～5d ，观察。

6、计数：用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，报告细菌总数/(CFU·ml-1)

7、纯化：挑取典型菌落接种于相应平板，培养条件同上，培养纯化。

五、思考题

1、分离放线菌和真菌为什么需要分别加重铬酸钾和链霉素？

2、怎么检验培养皿上的某个单菌落是不是纯培养？