免疫组化染色步骤-冰冻切片

主要试剂：

Triton X-100（上海生工，货号：0694-100ml ）；

0.3% 和0.03% H 2O 2（国药集团，分析纯AR ，30%, 货号：10011218）； 5% normal goat serum （ S-1000，Lot ：Y0123，Vector ）；

一抗：Truus rabbit anti- human AVP(23-06-‘86)（1:1000）【荷兰赠送】；

二抗：biotinylated goat anti-rabbit IgG （1:200; catalog-BA-1000 Lot NO. X0524, vector ,burlingame, USA ）；

ABC Kit ：peroxidase standard PK-4000, vectastain®, vector , USA （1:200） DAB ：0.05% 3,3’-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

溶液配制：

1、10× Tris Buffered Saline (TBS) 、10× TBST 配方：

24.2 g Tris base ，80 g NaCl ，adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1×).

10×TBST （3% Triton ）：30ul Triton-100 + 970ul TBS （37℃）

2、 0.3% H2O2 + 0.5%Triton + TBS ：【注意避光，提前20min 配，37o C 水箱溶解Triton 】 99ml TBS （1×） 500µl Triton

【先把Triton 溶解在TBS 中后，再加入H 2O 2。】

3、 抗体配制方法：

抗体 + 羊血清 + TBST （0.3%Triton-100），即TBST 来稀释抗体（稀释倍数视抗体而定）和羊血清（稀释成5%）。

4、 ABC 溶液：【提前30分钟配制，室温放置】

A:B = 1:1，然后AB:TBST = 1:200（注意：A 、B 与TBST 的比例都是1:200，即200ul 中加1ulA 和1ulB ）。

5、 DAB 溶液：【注意避光】：DAB 即3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride ，中文名为二氨基联苯胺或联苯二胺，分子式为C12H14N4·4HCl ，分子量为360.1 【sigma ，D5637,027K37251】

【DAB 显色】 0.05% DAB + 0.03% H2O2 + TBST 【配1ml 工作液：50ul 1%DAB + 1ul 30% 浸入40℃温水中（将一小烧杯置于盛有温水的较大烧杯中），充分搅拌，加入30% H 2O 21ml

0.5M Tris-HCl（贮存液）：60.55g溶解于900ml双蒸水中，HCl调pH=7.6，定容至1L。

1%DAB（贮存液）：用0.05M Tris-HCl溶解DAB粉末（称多少溶多少，大约每次5ml的量即可【最好晚上配制，称量时容易稍微避下光】），配成1%DAB溶液，分装（每EP管1ml）-20o C避光保存（0.5M Tris-HCl稀释10倍再用）。【整个过程要避光。配制的容器用棕色瓶子，分装的EP管用锡纸包裹起来】

实验原理

免疫组织化学正是利用抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB 显示为棕黄色颗粒）。在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。

实验步骤：

第一天Part1

1、在6孔板表面（大鼠全脑切片每孔最多5片，树鼩全脑切片每孔最多4片，每孔最少加溶液600ul才能完全覆盖切片），做好标记；

TBS（pH=7.6，下同）洗10 min×3，每孔加入2ml洗液，置摇床上，转速60-80rpm；

2、通透、消除内源性过氧化氢酶：用0.3% H2O2和0.5%Triton 混合液处理切片30min，置于摇床上，避光，50rpm。

3、TBS洗10 min×3，每孔加入2ml洗液，置摇床上，50rpm；

4、封闭：先用划线笔小心把各脑片分开并平铺开来，如果褶皱的比较厉害的，可在另外的空孔内加入3mlTBS，然后把次片子用笔挑入此孔内，把其展开后再用粗笔把它挑回原孔重新展开，小心用1ml吸出TBS（6孔板不能倾斜，否则展开的片子又会重新折叠），吸干洗液后，在每孔内滴入500ul 5%羊血清，做到完全覆盖住组织，然后将6孔板放入恒温水箱（37℃）中；

5、孵育一抗：将孔板取出，按照4步骤小心吸去封闭液，加入500ul 的rabbit anti-human A VP （1:1000）（荷兰脑研究所赠送），做到完全覆盖住组织，置恒温水箱（37℃）。

6、放入4℃冰箱中过夜。

第二天Part2

7、取出孔板，37度放30min, TBS洗10 min×3，置摇床上，50 rpm。

8、孵育二抗：先用划线笔小心把各脑片分开并平铺开来，如果褶皱的比较厉害的，可在另外的空孔内加入3mlTBS，然后把次片子用笔挑入此孔内，把其展开后再用粗笔把它挑回原孔重新展开，小心用1ml吸出TBS（6孔板不能倾斜，否则展开的片子又会重新折叠），每孔加入500ul的biotinylated goat anti-rabbit IgG（1:200; catalog-BA-1000 Lot NO. X0524, vector ,burlingame, USA）【in TBST：0.5% Triton-X 100】，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中；

9、【配ABC】取出湿盒，将二抗吸去，TBS洗10 min×3，置摇床上，50rpm。

10、孵育ABC：小心展平各个切片，小心吸去TBS，每孔加入500ul的ABC【AB（1:1），A：TBS=1:200，B：TBST=1:200，提前30分钟配制，室温放置】，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中【中间把片子水平摇几下，使液体能与组织充分接触】。

11、TBS洗10 min×3，置摇床上，50rpm。

12、DAB显色：【避光】加入500ul的DAB，快速滴入，显色4min

13、先用TBS洗5 min×2，置摇床上。室温2h。

14、锚片：把0.5% gelatin（明胶）溶液倒入玻璃皿中，把染好的片子挑入0.5% gelatin溶液中，放入未包埋的干净载玻片，左右手持细毛笔小心把片子涮到载玻片上，并且展平，快速拿到显微镜先初步观察（片子不要干），如果关键部位没有展平，则放入gelatin溶液中重新锚片。

在晾片板上把片子平放，室温10min，装入晾片架，外罩PE手套（顶端开口），37度，过夜。

第三天Part3

15、晾干的片子放入TBS中洗：5 min×3，摇床上，50rpm；

16、脱水、透明：第一排试剂瓶从左至右（alcohol→二甲苯），

3min 70% Alcohol→3min 80% Alcohol→3min 90% Alcohol→3min 95% Alcohol→3min 100% Alcohol→3min 100% Alcohol→5min二甲苯→5min二甲苯】

封片：滴少量树胶于组织上，盖上盖玻片；

17、镜检：