整理)流式细胞检测细胞周期

一、所需试剂

1、细胞周期检测试剂盒

（1）PI：Propidium Iodide，碘化丙啶，是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，如果自己买，那就10mg用200mlPBS溶解，4℃避光保存（0.05mg/ml）

（2）RNAase：PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解，如果自己买，那就100mg用20mlPBS溶解，200μl分装-20℃避光保存（5mg/ml）

2、预冷70%-75%酒精：可用无水乙醇和纯水配制

3、预冷PBS

4、流式管：可以去医研中心拿

二、实验步骤

<一>、细胞处理

1、种板处理等同功能实验（保证细胞有2-5×10*5个）

2、消化细胞，离心(1000r/300g  5min)收集细胞沉淀。

3、用预冷的PBS清洗细胞1-2次。

4、离心(1000r/300g  5min)收集细胞沉淀

5、固定细胞：用0.2ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入2ml预冷70-75%酒精，震荡，4℃固定过夜。（直接向细胞加入酒精容易使细胞成团，震荡不要过猛，容易使细胞破碎）

<二>、细胞染色和检测

1、离心（1000r/300g  5min）收集固定的细胞

2、2mL的预冷PBS洗细胞一次，离心再次获取细胞沉淀

3、染色：加入50μlRNA酶和250μl-450μl PI染色剂（用量根据试剂盒说明书），避光染色5-10min（一般加300μl，保证适当细胞浓度，浓度太高检测速度太快，结果不准；浓度太低检测速度太慢，时间太长）

4、上机检测

三、注意事项

1、流式细胞仪原理看ppt

非荧光信号

（1）前向角散射光（FSC Forward scatter）细胞相对大小及其表面积 

（2）侧向角散射光（SSC side scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性

2、PI(碘化丙啶)不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm。PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测

3、有人说需要设置内参（5％鸡红细胞）

4、细胞周期：

（一） 间期

间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

1. G1期（first gap）　从有丝到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。

2. S期（synthesis）　即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。

3. G2期（second gap）期为DNA合成后期，是有丝的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。

（二）期

M期：细胞期。

G0期：暂时离开细胞周期，停止细胞，去执行一定生物学功能的细胞所处的时期

结果图

5、凋亡峰

凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。

（更新于2018.11）