GSK和proteasome免疫荧光共定位详细步骤

2.24孔板中滴少量培养液，浸在100%酒精中的爬片，在酒精灯上灼烧后放入孔中（注意此时需要晾比较长的时间，以免细胞被烫伤），24孔板接种细胞，浓度以60~80个/μl为标准，量为300μl/孔；

3.细胞一般培养两天后处理，选择较好的孔进行标记；

4.PBS漂洗2次，2×5min（300μl/孔）；

5.100%甲醇-20℃预冷，-20℃固定细胞 8min（300μl/孔）；

6.0.2%Triton-PBS，漂洗3×5min（300μl/孔），摇床上摇动；

7. 0.5%Triton-PBS，破膜8min （300μl/孔），摇床上摇动；

8. 0.2%Triton-PBS，漂洗3×5min（300μl/孔），5%BSA（含有0.02%NaN3）封闭1h（300μl/孔），加一抗（100μl/孔）（GSK-3与proteasome都为1：500），室温下摇2h，4℃孵育两天；

9. 4℃拿出之后，常温摇30min，37℃孵育1h，以为一抗能够很好的结合，且回收一抗；

10. 0.2%Triton-PBS，漂洗3×10min（300μl/孔）；

11.二抗（1：80，避光用5%BSA配制，100μl/孔）37℃孵育1h；

12. 0.2%Triton-PBS，避光漂洗3×10min（300μl/孔）；

13.Hoechst（1μg/ml）复染15min（100μl/孔），0.2%Triton-PBS，避光漂洗3×10min（300μl/孔）；

14.50%磷酸-甘油封片；

15.激光共聚焦显微技术观察；

16.避光4℃保存爬片，以备再次照相。