RUBP酶活性测定

一、鲜样酶液的提取

【步骤】：

1.    称取鲜叶片0500 g左右，置于预冷的研钵中，加适量经酸洗的预冷过的石英砂，加1ml预冷过的提取缓冲液，冰浴研磨，至基本磨碎后再加1ml提取缓冲液进一步充分研磨提取；

2.    转移到10ml的离心管中，分别用2ml的提取缓冲液冲洗2次，在首次转移时尽量做到无损转移；

3.    每个样品的提取体积为6ml；

4.    提取完全的酶液在15000×g条件下离心10min，温度为4℃，然后转移上清至相应的离心管中于4℃冰箱保存，待测

提取缓冲液的配制－酶提取buffer

【下面所有试剂以配制1000ml buffer提取液为例进行各组分的预算】

①    0.1mol/l的Tris－HCl 缓冲液，pH＝8.4

0.1×1×121.14(MW-Tris的分子量)×纯度＝12.125g，加900ml左右的水，用盐酸调pH＝8.4，然后加入下面各组分后定容至1000ml；

②    10mmol/l的MgCl2溶液，含6个结晶水，分析纯度为98%

10×10－3×1×203.3＝2.033/0.98＝2.0745g

③    1mmol/l的EDTA溶液：1×10－3×1×372.24＝0.37224g

④    7mmol/l的－巯基乙醇溶液：7×10－3×1×78.13/0.99＝0.5524g

⑤    5%（V/V）甘油：50ml量筒量取

⑥    1%PVP：10g

将以上6种试剂最后定容到1000ml容量瓶中

三、RuBPCase反应体系的配制（混合反应液总体积为3ml）

①    50mmol/l的Tris－HCl 缓冲液，pH＝8.0，每次反应加0.3ml，配1000ml

50×10－3×1×121.14＝6.07g（下面所有试剂的配制均以缓冲液进行，按照100个样品预算试剂）

②    20mmol/l的MgCl2溶液，每个反应加0.3ml，配100ml

20×10－3×0.1×203.3/0.98＝0.4148g

③    5mmol/l的DTT溶液，每个反应加0.3ml，配100ml

5×10－3×0.1×154.2＝0.0771g

④    2mmol/l的NADH溶液，每个反应加0.3ml，配100ml

2×10－3×0.1×709.4＝0.14188g

⑤    30mmol/l的ATP溶液，每个反应加0.3ml，配50ml

30×10－3×0.05×605.2＝0.9078g

⑥    1mmol/l的EDTA溶液，每个反应加0.3ml，配100ml

1×10－3×0.1×372.24＝0.037224g

⑦    10mmol/l的NaHCO3溶液，每个反应加0.1ml，配100ml

10×10－3×0.1×84.01＝0.08401g

⑧    3-磷酸甘油酸激酶/3-磷酸甘油酸脱氢酶（15U/15U，每个重复）0.1ml，配12ml

3-磷酸甘油酸激酶，2000U/瓶，来自酵母

3-磷酸甘油酸脱氢酶，5000U/瓶，来自兔子肌肉

⑨    10mmol/l的KCl溶液，每个反应加0.3ml，配100ml

10×10－3×0.1×84.01＝0.08401g

⑩    水：0.5m

（11）    9 mmol/l的RuBP溶液，每个反应加0.1ml，配12ml

9×10－3×0.012×310.09＝0.0335g

步骤

其中，①、②、⑥、⑦、⑨、⑩试剂混合在A烧杯中，需要1.8ml加样器1把；

③、④、⑤、⑧试剂混合在B烧杯中，需要1ml加样器1把；

酶液0.1ml加样器1把；

RuBP溶液0.1ml加样器1把；

共4把加样器。

在30℃恒温水浴下10min，加入0.1ml RuBP溶液，最后加入0.1ml酶液启动反应，立刻于340nm下测定吸光值的减少。