优化L_精氨酸发酵培养基

Ｌ－精氨酸是一种重要的半必需氨基酸，它是合成蛋白质和肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环中的重要代谢产物。Ｌ－精氨酸在医药和食品工业中有着广泛的应用，除了传统上应用于复方氨基酸输液以及氨中毒性肝昏迷的解毒剂以外，Ｌ－精氨酸在提高人体免疫力、促进伤口愈合、防治肿瘤等方面也有一定的作用［１］。近年来，随着人们对一氧化氮途径研究的不断深入，作为一氧化氮合成前体的Ｌ－精氨酸在心血管疾病的防治中日益受到重视［２］。Ｌ－精氨酸同时也是配制营养支持用和特殊支持用要素膳的重要原料，Ｌ－精氨酸－Ｌ－谷氨酸盐还被用作忌钠患者的调味品等。

国外只有日本实现了发酵法大规模生产Ｌ－精氨酸。目前国内有少量采用毛发水解等方法生产的Ｌ－精氨酸［３］。国内对发酵法生产Ｌ－精氨酸的研究仅限于实验室水平，是我国药用氨基酸生产的“瓶颈”品种之一。本实验通过筛选得到一支产Ｌ－精氨酸的谷氨酸棒杆菌ＺＨ－０３，在对其发酵特性研究的基础上，通过响应面分析的方法对其培养基进行了优化。

１材料与方法

１．１菌株和培养基

以Ｌ－精氨酸产生菌ＺＨ－０３（本实验室保藏菌株）为实验菌株。琼脂斜面传代物在４℃保存，每４周转接一次。

菌种斜面保藏培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１，牛肉膏１０，蛋白胨１０，ＮａＣｌ５，琼脂２０。（灭菌前ｐＨ７．０）。

完全培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１０，蛋白胨１０，牛肉膏１０，ＮａＣｌ５，琼脂２０。（灭菌前ｐＨ７．０）。

种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２５，（ＮＨ

４

）２ＳＯ４５，玉

米浆３０，ＫＨ

２

ＰＯ４１，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５，ＣａＣＯ３１０。（灭菌前ｐＨ７．０）。

发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１２５，（ＮＨ

４

）２ＳＯ４３０，玉

米浆１０，ＫＨ

２

ＰＯ４１．５，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５，ＣａＣＯ３３０。（灭菌前ｐＨ７．０）。

１．２发酵与检测

将精氨酸产生菌ＺＨ－０３从完全培养基上挑取ｌ环接种于３０ｍＬ液体种子培养基中，在往复式摇床上３０℃，震荡培养２４ｈ后以１０％接种量接种于装有１５ｍＬ发酵培养基的２５０ｍＬ三角瓶中，３０℃震荡培养９６ｈ，转速为１００ｒ／ｍｉｎ。发酵液中精氨酸用坂口试剂定量测定［４］。

１．３培养基优化［５］

用ＳＡＳ软件中二水平设计筛选重要影响因素，再用响应面分析法对重要因素的水平进行优化。

１．３．１二水平设计：选１０个因素、试验次数为２４的Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计，可考察各因素的主效应和交互作用的一级作用。

１．３．２响应面分析：根据Ｂｏｘ－Ｂｏｈｎｋｅｎ的中心组合设计原理［６］，由二水平设计确定的３因素各取３水平。设计了３因素３水平共１５个试验点的响应面分析。

２结果与分析

２．１二水平设计

用ＳＡＳ软件的二水平设计分析各因素的主

优化Ｌ－精氨酸发酵培养基

张义萍，

（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡２１４０３６）

摘要：利用ＳＡＳ软件中二水平设计和响应面分析法较系统地研究了谷氨酸棒杆菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ－ｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）精氨酸发酵培养基，得到了精氨酸产量在一定条件下随硫酸铵、玉米浆、磷酸二氢钾的变化规律，并根据分析结果优化了发酵培养基，产量可提高近６４％。

关键词：ＳＡＳＰｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计法响应面分析培养基优化

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发酵科技通讯

第３５卷第２期２００６年４月

２．２．２建立二次响应面回归模型

回归方程为：

Ｙ１＝４．３０７５８＋２７７．３９８Ｘ１＋９５．９０３Ｘ２＋１０７３．６７Ｘ３－

４４０９．７８Ｘ１２－３８２４．２０Ｘ１Ｘ２－９７４０９２Ｘ３２

模型可信度分析见表２，其中复相关系数的平方Ｒ２＝０．９６３１，说明由这３个因素及其二次项能解释Ｙ变化的９６．３１％，模型拟合程度很好［７］。效应，即其它因素不变时，某单个因素的变化对响应值的影响。实验结果表明硫酸铵、玉米浆、磷酸二氢钾对ＺＨ－０３产酸有显著影响。因此，利用响应面分析对硫酸铵、玉米浆、磷酸二氢钾３个培养基组分进行更深入研究。

２．２响应面分析２．２．１实验设计与结果

二水平设计试验确定了３因素，即硫酸铵、玉米浆、磷酸二氢钾。根据Ｂｏｘ－Ｂｏｈｎｋｅｎ的中心组合设计原理，３因素各取３水平，设计了３因素３水平共１５个试验点的响应面分析实验，在中心值重复３次实验。所得数据分析见表１，可见３因素对精氨酸产量的影响并非简单的一次线性关系，而是呈二次抛物面关系。一次项对Ｙ有一定影响，交叉乘积项对Ｙ有显著影响。

表１回归方程的方差分析

ＭａｓｔｅｒＭｏｄｅｌ

ＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅＭｏｄｅｌ

ＳｏｕｒｃｅＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ１＊Ｘ１Ｘ１＊Ｘ２Ｘ１＊Ｘ３Ｘ２＊Ｘ２Ｘ２＊Ｘ３Ｘ３＊Ｘ３ＭｏｄｅｌＥｒｒｏｒ

ＤＦ１１１１１１１１１９５

ＳＳ

０．０００１６５０．００００１８０．０１９８３２０．６８８７３８０．１４６２４５０．０３７２２５０．０５１４７９０．０２０６９０．２０２９３８１．１６５７７１

０．０４４６１６ＭＳ

０．０００１６５０．００００１８０．０１９８３２０．６８８７３８０．１４６２４５０．０３７２２５０．０５１４７９０．０２０６９０．２０２９３８０．１２９５３

０．００８９２３

Ｆ

０．０１８４７７０．００１９８８２．２２２５４６７７．１８５６７１６．３８９３８４．１７１７９

５．７６９１９４

２．３１８７１８２２．７４２９１１４．５１６２

Ｐｒ＞Ｆ

０．８９７１８０．９６６１６３０．１９６２０３０．０００３１７０．００９８４１０．０９６５６１０．０６１４７５０．１８８３２１０．００５０１９０．００４４２７

ＤＦ１１１１１

１６８

ＳＳ

０．０００１６５０．００００１８０．０１９８３２０．７２２２８６０．１４６２４５０．２２０２７１１．０５６３７６０．１５４０１１ＭＳ

０．０００１６５０．００００１８０．０１９８３２０．７２２２８６０．１４６２４５

０．２２０２７１０．１７６０６３０．０１９２５１

Ｆ

０．００８５６４０．０００９２１１．０３０１６７３７．５１８７３７．５９６６

１１．４４１８５９．１４５４７５Ｐｒ＞Ｆ

０．９２８５４２０．９７６５２８０．３３９８２９０．０００２８２０．０２４８２

０．００９６０５０．００３１７４表２模型可信度分析

ＭｅａｎＲ－ｓｑｕａｒｅＡｄｊ．Ｒ－ｓｑｕａｒｅＲＭＳＥＣＶ

ＭａｓｔｅｒＭｏｄｅｌ

１．５８４３３２９６．３１％８９．６８％０．０９４４６２５．９６２２８５

ＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅＭｏｄｅｌ１．５８４３３２８７．２８％７７．７３％０．１３８７４９８．７５７５８５

由图１的响应面立体图可看出Ｘ１、Ｘ２和Ｘ３

存在极值点，为了进一步验证最佳点的值，对回归方程取一阶偏导等于零并整理得

：

２７７．３９８－４４０９．７８×２×Ｘ１－３８２４．２０Ｘ２＝０

９５．９０２８－３８２４．２０Ｘ１＝０１０７３．６７－９７４０９２×２×Ｘ３＝０

２．２．３响应因子水平的优化

图１响应面分析的立体图

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发酵科技通讯

第３５卷

解得：Ｘ１＝０．０２５，Ｘ２＝０．０１４９，Ｘ３＝０．０００５２代入回归方程，解得预测的精氨酸的最优产量Ｙ＝８．７９ｇ／Ｌ。

即：培养基中硫酸铵浓度为２５．０ｇ／Ｌ，玉米浆浓度为１４．９ｇ／Ｌ，磷酸二氢钾浓度为０．５２ｇ／Ｌ。考虑到实际操作的便利，确定培养基的最优配方为：硫酸铵浓度为２５ｇ／Ｌ，玉米浆浓度为１５ｇ／Ｌ，磷酸二氢钾浓度为０．５ｇ／Ｌ。

为了证实预测的结果，用以上得到的最优配方重复实验３次，平均精氨酸产量为８．７０ｇ／Ｌ±

０．１２，预测值Ｙ＝８．７９ｇ／Ｌ与实验值之间良好的拟

合性证实了模型的有效性，回归方程为精氨酸的发酵提供了一个合适的模型。

３结论

实验证明响应面分析法对培养基优化是非常有效的。二水平试验用很少的实验对多个因素进行考察能有效地找出主要因素，分别为硫酸铵、玉米浆、磷酸二氢钾。通过响应面实验对３个主要因素进一步优化，找出最佳值。经过响应面方法优化的最佳培养基配方组成为（ｇ／Ｌ）：硫酸铵

浓度为２５，玉米浆浓度为１５，磷酸二氢钾浓度为

０．５。在此优化的培养基中菌株ＺＨ－０３产精氨酸

浓度由最初的５．３５ｇ／Ｌ提到８．７９ｇ／Ｌ，提高了近

６４％。

参考文献

［１］罗旭松，岑瑛．精氨酸对创伤后肌体影响的研究进展［Ｊ］．

中国修复重建外科杂志，１９９７，１１（２）：１２４￣１２６．

［２］尹时华．Ｌ－精氨酸与心血管病研究进展［Ｉ］．心血管病学

研究，２０００，２１（４）：２３４￣２３６．

［３］，钱和．氨基酸生产技术及其应用［Ｍ］．北京：中国

轻工业出版社，１９９７：１９．

［４］郝刚，钱和．发酵液中Ｌ－精氨酸定量检测方法的研究［Ｊ］．食品工业科技，２００５，２６（２）：８４￣８６，

［５］吴有炜，试验设计与数据处理［Ｍ］．苏州：苏州大学出版

社，２００２：１３５￣１４２．

［６］ＴｈｏｍｐｓｏｎＤＲ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＦｏｏｄＰｒｏｃＰｒｅｓ，１９８２，（６）：１５５．

［７］ＫａｒｉＫｙｌａ－ｎｉｋｋｉｌａ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，６６（９）：３８３５￣３８４１．

称取样品５．００００ｇ，精确至０．０００２ｇ，用０．０１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液溶解，并稀释至１００ｍｌ。吸取上述试液５．００ｍｌ，用０．０１ｍ／Ｌ盐酸溶液稀释至１００ｍｌ。再用１０ｍｍ比色杯，以０．０１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液作空白，在紫外分光光度计２６０ｎｍ处测定其吸光值；

５′－鸟苷酸钠（Ｃ１０Ｈ１２Ｏ８Ｎ５・Ｎａ２・７Ｈ２Ｏ）含量％

＝

———编者——

—特鲜味精５′－鸟苷酸钠含量测定方法

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４００×５３３×

吸光值１２．２×１０３×１０００

×１００简化后＝吸光值×１．７５（其中１．７５为稀释倍数４００的常数值）

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