棉花耐旱相关基因的cDNA_AFLP差异显示

12 24基金项目:国家自然科学基金项目(30760124)

作者简介:邓晓艳(1983 ),女,硕士生,专业方向为植物遗传;e mail:shzdxy @sina.com 。通讯作者:魏亦农(19 ),男,教授,从事棉花遗传育种研究;e mail:weiyinong @163.co m 。

第28卷 第5期2010年10月

石河子大学学报(自然科学版)

Journal of Shihezi University(Natural Science)

Vol.28 No.5Oct.2010

文章编号:1007 7383(2010)05 0537 05

棉花耐旱相关基因的cDNA AFLP 差异显示

邓晓艳1,刘江娜2,李志博2,刘菲菲2,章杰2,郗忠玲1,魏亦农2

(1石河子大学生命科学学院,石河子832003;

2石河子大学农学院/兵团绿洲生态农业重点实验室,石河子832003)

摘要:为鉴定棉花干旱胁迫响应基因,应用cDN A AF L P 技术,以棉花耐旱品种晋棉13号幼苗为研究对象,对干旱胁迫早期叶片基因表达进行了mRN A 指纹分析。通过对引物组合的筛选,共分离得到232个差异表达的转录衍生片段(T D Fs),对其中102个T DF s 进行了克隆、测序和序列分析。结果表明:45个T DFs 与NCBI 中已有序列同源,功能涉及信号传导、转录以及逆境诱导蛋白等,另有57个T DF s 无同源序列或同源性低,预测其为是一些未知功能基因。

关键词:棉花;干旱胁迫;cDN A AF L P;差异表达基因中图分类号:S332.1;Q78 文献标识码:A

Analysis of the Responsive Genes during Drought in Cotton

by Means of cDNA AFLP

DENG Xiaoyan 1,LIU Jiangna 2,LI Zhibo 2,LIU Feifei 2,

ZH ANG Jie 2,XI Zhongling 1,WEI Yinong 2

(1Colleg e of L ife Science,Shihezi U niv ersity 1,Shihezi 832003,China;2College o f Ag r iculture,Shihezi U niver sity/K ey

Labor ator y o f Oasis Ecolog y A gr iculture o f Xinjiang Pr oduction and Co nstr uct ion Gr oup,Shihezi 832003,China)

Abstract:In order to identify genes invo lved in drought stress responses in cotton,cDNA AFLP appr oach w as employ ed to identify genes differentially expressed in cotton leaves at dro ug ht stress.Six ty four primer com binations w ere used for selective amplification.Tw o hundred and thirty tw o TDFs w ere selected fo r their differ ential ex pression under droug ht stress.Among the 232TDFs,one hundred and tw o TDFs w ere cloned and sequenced.Compared w ith the publicly available databases,45T DFs presented so me significant similarities w ith know n plant sequences,w hose functions are involv ed in gene regulation,transcr iption fac to r,sig nal transductio n,stress defense,etc.Fifty seven TDFs w ith lo w identity and no match to know n genes may represent novel cotton g enes.

Key words:cotton;dr oug ht stress;cDNA AFLP;differentially ex pressed genes 干旱是全球面临的严重问题之一,也是制约我国农业生产的主要因素。据统计,全世界约43%的耕地受到干旱、半干旱的威胁[1],因此,提高作物的抗旱能力是现代农业研究中的热点和重点问题之一。

棉花是我国乃至全世界重要的经济作物。

是西北五省干旱区之一,属于干旱荒漠地带,气候干燥,同时又是我国最大的棉花生产基地之一,开荒植棉面积逐年扩大。目前全疆耕地面积402.55万hm 2,其中棉花种植面积约126万hm 2[2]。棉花属

随着分子生物学的不断发展,利用生物技术手段,培育抗旱、耐旱棉花品种成为可能。目前研究基因差异表达的技术主要有DD PCR、RDA、SSH、SA GE、基因芯片技术、cDNA AFLP[6]。cDNA AFLP技术是一种新的研究基因差异表达的技术,因其具有可靠性高、重复性好、假阳性率低,不需要预先知道序列信息,且所需仪器设备简单的特点[5],被广泛应用于生物体基因表达特性的研究。目前,利用cDNA AFLP技术已在藜属植物[6]、拟南芥[7]、马铃薯[8]、番茄[9]等植物中分离出抗虫、抗病、抗干旱等多个抗性基因。

本研究采用cDNA AFLP技术,分离出与棉花耐旱有关的cDNA片段,试图从棉花中克隆出耐旱相关基因,以期为进一步阐明棉花耐旱性分子机理奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以耐旱材料晋棉13号为实验材料,将晋棉13号的种子浸泡过夜,然后转入铺有滤纸的培养皿中,待发芽后,转入盛有H oagland营养液[10]的塑料盒中培养。

当幼苗长至两叶一心时,用浓度分别为20%和30%的PEG6000进行干旱胁迫,整个培养过程在25 进行。胁迫时间分别为0h、2h、4h、8h、12h、24 h、48h。剪取叶片于液氮中速冻,-70 保存备用。

1.2 方法

1.2.1 RN A的提取及双链cDN A的合成

分别取对照和胁迫后的棉花叶片,用改良的CT AB法[11]提取其总RNA。

cDNA双链合成按照Takar a的M MLV RT ase cDNA Synthesis Kit(M M LV versio n) (Code N o.D6130)中介绍的方法,先以Olig o(dT) 18Primer为引物,合成cDNA第一链,然后通过E.coli RNaseH使杂合链中RNA形成单链切口,在E.coli DNA Poly merse I与E.coli DNA ligase的作用下合成cDNA第二条链。合成的双链cDNA 用U biquitin gene(UBI)[12]进行检测。

1.2.2 cDN A AF LP分析

cDNA200ng,10U/ L M seI和EcoR 各1 L,10 Reaction buffer2.5 L,T4DNA连接酶(3 U/ L)1 L,10mm ol/L AT P2.5 L,M seI和EcoRI人工接头(50 m ol/L)各0.5 L,用ddH2O 补足至20 L,在37 下保温5h,8 保温4h,然后4 过夜。

取酶切连接后的产物2 L,M0和E0(50 g/L)各0.5 L,10 PCR buffer2.5L,dNT P0.5L, T aq酶(2U/ L)0.5 L,用ddH2O补足至20 L,进行预扩增。

预扩增引物序列:

E05 GACTGCGT ACCAA TT CA C 3 ;

M05' GAT GAGT CCT GAGT AACT 3 。

PCR反应为预变性94 2min,变性94 30 s,退火56 30s,延伸72 80s,30个循环,延伸加时72 5m in,产物稀释20倍备用。稀释后产物2 L,引物(50ng/ L)各1 L,10 PCR buffer 2.5 L,dNTP0.5 L,Taq酶(2U/ L)0.5 L,用ddH2O补足至20 L,进行选择性扩增。

选择性扩增引物序列:

EcoRI primers E0 AGC,E0 ACT,E0 A CG,E0 AGG,E0 ACC,E0 ACA,E0 AA G,E0 AAC;

M se I primers M0 CAG,M0 CTC,M0 CT G, M0 CT T,M0 CTA,M0 CAA,M0 CAT,M0 CAC。

PCR反应为预变性94 2min,变性94 30 s,退火65 30s并且每个循环降低0.7 ,延伸72 80s,14个循环,接下来按下列参数扩增23轮:94 30s,55 30s,72 80s,最后延伸72 5min,产物备用。

1.2.3 电泳及银染

选择性扩增产物加上样缓冲液,变性后通过6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,分离后用银染色[13],染色完成后统计结果。

1.2.4 差异片段的回收、克隆及测序

选择有明显差异的条带进行回收,用与原来相同的选择性扩增引物进行第2次扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的真实性。

T IAN gel M idi Purificatio n Kit回收试剂盒回收纯化目的片段,Promega的pGEM T载体试剂盒

538 石河子大学学报

进行回收条带的克隆,所得阳性克隆由上海生工进行测序。

1.2.5 生物信息学分析

对获得序列利用BLASTN 和BLAST X 程序与网上数据库(N CBI,national center for biotech nolo gy inform ation)进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 R N A 的提取结果及cDN A 的质量

本实验利用改良的CTAB 法提取总RNA,紫外分光光度计测得D 260nm 与D 280n m 的比值为1.8~2.0,表明RNA 纯度较高;1.0%琼脂糖检测发现rRNA 的28S 和18S 清晰(图1),这说明RN A 完整性较好,无降解,蛋白质和酚类物质的污染少,能够满足反转录cDNA 要求。

以U BI 为内参扩增的目的片段,琼脂糖电泳检测在200bp 处出现亮的条带(图2),说明反转录成功,可用于AFLP

标记的分析。

图1 棉花叶片RN A 电泳图谱 Fig.1.R NA of cotton leaf

图2 棉花叶片cDN A 质量检测Fig.2cD NA quali ty of cotton leaf

2.2 棉花叶片对照、干旱胁迫条件下基因差异表达谱

本实验选取8个M seI 引物和8个EcoRI 引物,组成个引物组合对其进行了差异表达基因的筛选,图3为部分引物组合的扩增产物,结果表明E +CC/M +AG 、E+CT /M +AG 等引物组合可以扩

增出较稳定的条带。

奇数标记的是20%P EG 6000胁迫4h 的样品,偶数标记的是相应的对照组,每一对为同一引物组合扩增 的条带,如1和2的引物组合为E+CA /M +AC 图3 部分引物组合的扩增产物(未列全)Fig.3Am plifi ed pr oducts of several pri m er pairs

图3显示了筛选差异片段以下5种情况。

1)在干旱胁迫和对照中的表达无明显差异的,如图3中第9和第10泳道。

2)某一基因在干旱胁迫处理下比在对照条件下

减弱,如图3中A 指示的谱带。

3)某一基因在干旱胁迫后表达,而在对照情况下没有表达,如图3中B 指示的谱带。

4)某一基因在干旱胁迫处理下,比在对照条件下强,如图3中C 指示的谱带。

5)某一基因在对照条件下表达,而在干旱胁迫情况下不表达,如图3中D 指示的谱带。

2.3 差异表达片段的分析和功能预测

由于cDNA AFLP 技术显示的是植物基因在表达水平上的差异,所以无论扩增的是质的差异还是量的差异,均能正确反应出基因在整个发育阶段的表达变化。

为了能进一步阐明棉花对干旱胁迫条件的适应调节机制,将回收的232条片段进行二次扩增,选择

出102条表达稳定的差异条带进行测序,Blast 比对结果表明:与已知基因有同源性的片段有45条,约占测序数的44%,另有57条片段与已知基因或序列无任何同源性,可能是因为片段较短或是尚未发现的新基因。

表1列出了与耐旱性密切相关的13个cDNA 片段的信息。有些基因只与生物的基本生长和代谢有关,在此未全部列出。

539

第5期 邓晓艳,等:棉花耐旱相关基因的cDN A -A FL P 差异显示

Tab.1cDN A sequences related to cotton reaction to drought stress

类型编号大小 编码可能的蛋白 物种e值

与信号传导有关T D F11261,4 葡聚糖分支酶A rabido psis2e-10 T D F3178A T P结合蛋白A rabido psis3e-17

T DF61156磷脂酰甘油磷脂酶C Py rus6e-08与胁迫有关T DF1293水稻渗透响应蛋白Or yza sat iva8e-09 T DF29102反转录转座子蛋白Cucum is 2.1

T DF31115抗性蛋白Gossy pium hir sutum4e-19

T DF80231抗性蛋白oppo site wo od3e-12与离子转运有关T DF3396液泡膜AT P合成酶Gossy pium hir sutum4e-22转录因子T DF42139tR NA L eu类转录因子Cucum is8e-41与渗透调节有关T DF9796醇脱氢酶A rabido psis 6.7

其它T DF84126预测蛋白trichocar pa6e-42 T DF104假拟蛋白Sorg hum2e-25

T DF93133非常规肌球蛋白Caenor habditis elegans9.8

3 讨论

干旱是作物生产面临的主要环境问题。高等植物对干旱胁迫的耐受性在一定程度上具有相似的分子基础,很多基因的表达受干旱胁迫的诱导并在植物抵抗干旱胁迫中起作用。

本试验利用cDNA AFLP技术从棉花中克隆了一些与干旱胁迫反应相关的cDNA片段,它们有可能在棉花的耐旱中起重要或决定性作用。

首先得到了几个与胁迫有关的基因片段,如水稻渗透响应蛋白(12号)、反转录转座子蛋白(29号)等。反转录转座子可分为LTR(lo ng ter minal r e peats)反转录转座子和非LTR反转录转座子[14],其为真核生物中一类可移动因子。反转录转座子的转录可以被多种生物或非生物的逆境所激活,如外伤、细胞培养等[15]。现有的研究证实,植物在逆境胁迫情况下,反转录转座子的活化可以调节植物抗逆相关基因的表达,是植物自我保护的一种反应[16],因此推测转座可能与植物发生防卫反应有关。本研究在干旱条件下表达的1个序列(29号)与黄瓜的反转录转座子蛋白具有较高的同源性,也说明了反转录转座子与植物的抗旱可能有关。但关于反转录转座子在植物抗旱方面的具体机制有待于进一步研究。

其次,分离到一个与离子转运有关的片段(33号),其编码液泡膜AT Pase B亚基。学者们[17 19]从棉胚珠中克隆出液泡H+ ATPase(v A TPase)的A (69kDa)、B(57kDa)、c亚基(16kDa),这三种亚基以A3B3c6形式组成H+ AT Pase全酶。A亚基和B亚基组成位于液泡膜朝细胞质一侧的Vl部分,A 亚基为催化肤,具有水解AT P酶的能力,而B亚基具有功能,c亚基为16kDa的蛋白脂质,构成与膜结合的VO部分,形成一个胞质H+跨膜进入液泡的通道。当土壤中存在高盐、干旱和重金属等胁迫时,细胞的存活主要依赖V型H+ AT Pase活性的维持和调整[20]。

第三,得到了几个与信号传导途径有关的基因片段,如1,4 葡聚糖分支酶(1号)、AT P结合蛋白(3号)、磷脂酰甘油磷脂酶C(61号)。其中磷脂酶C(pho spho lipase C,PLC)是磷脂酰肌醇信号通路的关键酶,在体内分布极为广泛。许多细胞外信息分子,如激素、神经递质、免疫球蛋白、细胞因子、生长因子等都可以激活磷脂酰肌醇特异性PLC。活化的PLC能水解磷脂酰肌醇 4,5 二磷酸(PIP2),从而产生2种重要的第二信使(二酯酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)),进而将细胞外信息传递给下游效应分子,调节细胞的生命活动[21]。另外PLC与甘油二酯激酶(DGK)协同作用产生磷脂酸(PA),在植物的生长、分化、繁殖等多种生物和非生物胁迫的信号传导中,PA均有作用。多种生物和非生物胁迫都可以诱导PA的产生,如病原体的侵入、干旱、盐胁迫及冷害等[22]。

从差异片段中分离到的另外几条片段,如预测蛋白(84号)、假拟蛋白(号)、非常规肌球蛋白(93号),均在胁迫后增强表达,初步推测与耐旱相关,具体功能有待进一步研究。

本研究克隆分离的13个cDNA特异片段的大小为93~231bp,片段偏短。其原因可能是本研究

540 石河子大学学报(自然科学版) 第28卷所采用的cDNA AFLP技术中进行cDNA酶切的酶为典型的EcoR 和Mse ,这样经过2种酶切成的cDNA模板片段可能较短,要获得更多的信息可以通过RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法得到全长cDNA序列。

4 结论

本研究利用cDNA AFLP技术,以棉花耐旱品种晋棉13号幼苗为研究对象,对干旱胁迫早期叶片基因表达进行了m RNA指纹分析。通过对引物组合的筛选,共分离得到232个差异表达的转录衍生片段(T DFs),对其中102个TDFs进行了克隆、测序和序列分析。生物信息学分析的结果表明:45个TDFs与NCBI中已有序列同源,功能涉及信号传导、转录以及逆境诱导蛋白等,这为棉花耐旱分子育种的进一步研究奠定了基础。另外有57个TDFs无同源序列或同源性低,因此预测其为一些未知功能基因。相信还有更多未知功能基因有待发现。

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