马铃薯渣蛋白抗氧化肽酶法制备技术研究

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2010国际农业工程大会论文集

马铃薯渣蛋白抗氧化肽酶法制备技术研究

王 蓓 马海乐

（江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013）

摘 要：本文以马铃薯渣为原料，采用酶法将薯渣中的蛋白转化成为具有抗氧化活性的

多肽。以酶解液对DPPH自由基清除率为酶解效果评价指标，从木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、

中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等6种商业蛋白酶中筛选出胰蛋白酶为最佳

水解用酶。通过优化试验，得出薯渣蛋白最佳酶解条件为：底物浓度4g/100ml、加酶量7%、pH8.0、料液温度50℃、酶解时间90min。酶解液稀释20倍后对DPPH自由基的清除率为72%，酶解液清除DPPH自由基的EC50值为0.155 g/100ml。

关键词：马铃薯渣；蛋白；酶解；抗氧化肽；DPPH自由基清除率

Enzymatic Preparation of Anti-oxidation Peptide from Potato Pulp

Wang Being Ma Haile

(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu 212013)

Abstract

Protease screening was studied to prepare potato antioxidant peptide with enzymolysis method. With potato dregs as raw material and scavenging rate of hydrolysate to the DPPH radical as an index, neutral protease was screened out from following six kinds of protease: papain, flavor protease, neutral protease, alkaline protease, trypsin and pepsin. The optimum hydrolysis conditions obtained by experiments are substrate 4g/100ml of concentration, 7% of enzyme-substrate ratios, pH8.0, 50°C and 30min of reaction time. After being diluted 15 times, scavenging rate of hydrolysate liquid to the DPPH radical reached 72%. EC50 value of hydrolysate scavenging DPPH radical is 0.155 g/100 ml.

Key word s：Potato pulp; Protein; Zymohydrolysis; Antioxidant peptide; Scavenging rate of DPPH radical

引言

马铃薯是一种分布广泛，容易栽培的宜粮宜饲的作物，在我国种植面积约7000万hm2[1]。2007年，我国马铃薯年产量已突破7000×104t，马铃薯种植面积和总产量均跃升至世界首位。

作为马铃薯淀粉生产过程中产生的主要副产物，马铃薯渣的主要成分为水、果胶、纤维素等

物质，其中蛋白质含量仅为1%～4%，淀粉含量小于1%，营养价值较低[2]，自带菌多达33种，不易储存、运输，变质后产生恶臭，造成环境污染。若烘干则成本过高，增加企业

负担，通常作为饲料或当成废渣作掩埋处理，但会导致土壤和地下水的污染，同时利用程度

较低[3]。这些问题迫使许多淀粉厂停止生产，是目前淀粉行业亟待解决的问题。

植物抗氧化（活性）肽能够消除自由基，抑制或消除以及减缓氧化反应。其抗氧化机理

包括：给抗氧化酶提供氢、缓冲生理pH值、螯合金属离子和捕捉自由基等[4]。本文将以马

铃薯渣为原料，采用酶解法制备生物活性肽，以酶解液对DPPH自由基的清除率为抗氧化

指标，选择最佳的水解用酶，进行酶解条件的优化试验。

基金项目：国家十一五支撑计划项目（2006BAD27B06）

作者简介：王蓓，硕士研究生，专业：粮食、油脂及植物蛋白质工程，研究方向：功能多肽制备技术。

通讯作者：马海乐，教授，博导。mhl@ujs.edu.cn。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

马铃薯渣，青海民和威思顿精淀粉有限责任公司（经气流干燥所得）；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH，分析纯)，Sigma公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司。

六种商业蛋白酶性能见表1。

表1 试验用蛋白酶的酶活及作用条件

Tab.1 Activities and action conditions of several protein enzymes 酶的种类缩写最适作用条件酶液稀释倍数酶活力(万U/g)特异性

木瓜酶 A pH6.0，T60℃5000 5.18 Arg-、Lys-、Phe-X-COOH 风味酶 B pH6.0，T50℃10000 5.65 作用范围广

中性酶 C pH7.0，T60℃1250 1.56 作用范围广

碱性酶 D pH9.0，T50℃10000 10.36 作用范围广

胰蛋白酶 E pH8.0，T50℃2500 0.77 Arg(Lys)-|-X 胃蛋白酶 F pH1.8，T37℃5000 1.39 作用范围广

HH-S型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗仪器厂；WFJ7200型可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；PHS-3C型精密pH计，上海精密科学仪器有限公司；LD5-2A 型离心机，北京医用离心机厂；Sartorius型电子天平（万分之一精度），北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶的初选

在相同的底物浓度、加酶量、酶解时间，以及每种酶推荐的最适温度和pH下，对薯渣进行酶解，初步筛选较优蛋白酶。称取10g薯渣，加蒸馏水配成底物浓度为5g/100ml的料液，于恒温水浴锅中加热至推荐的最适温度，调节料液至推荐pH后，按加酶量([E]/[S]) 5%加入一定量的蛋白酶，保温水解不同时间，酶解结束后，沸水浴灭酶10min，然后在3500r/min 离心10min，取上清液，并将其稀释20倍后，测定酶解液对DPPH自由基清除率。

1.2.2 单因素对酶解液清除率的影响

对选出的酶，进一步考察底物浓度、酶解时间、加酶量对其酶解效果的影响。在进行各单因素试验时，基本流程为：

一定底物浓度马铃薯渣液（料液体积选择200mL）→调节pH、温度到酶最适值→加酶→酶解一定时间→灭酶（100℃，10min）→离心（3500r/min，10min）→收集上清液→将上清液稀释到20倍后测定DPPH自由基清除率、测定酶解液的水解度。

1.2.3 蛋白酶酶解马铃薯蛋白工艺条件的优化

以单因素试验得到的最适条件为正交试验设计中心点，以酶解时间、底物浓度和加酶量为试验因素，设置3个不同的水平选用L9（34）正交表，安排9组试验，以DPPH自由基清除率为评定指标，优化最佳反应条件，并确定在此条件下马铃薯抗氧化肽的EC50。

1.2.4 清除DPPH自由基的测定方法

取2ml待测样品于试管中，再加入2ml浓度为0.04g/L的DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，反应20min，3500r/min离心分离10min，取上清液在517nm处测其吸光值为A i；另取2ml待测样品于试管中，分别加入无水乙醇2ml，反应20min，3500r/min离心分离10min，取上清液在517nm处测其吸光值为A j；以2ml 0.04g/L DPPH无水乙醇溶液和2ml无水乙醇反应作为参比，其吸光值记为A0。按照下式计算待测样品对DPPH自由基的清除率E(DPPH)(%)[5]：

()0

()[1100%

i j DPPH A A E A −=−

×

式中：A 0：2ml DPPH 无水乙醇溶液+2ml 无水乙醇的吸光值，A i ：2ml DPPH 无水乙醇溶液+2ml 待测样品的吸光值，A j ：2ml 无水乙醇+2ml 待测样品的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶的选择试验

6种蛋白酶的初选试验结果如图1所示。图1表明，薯渣经6种商业蛋白酶酶解所得的水解液对DPPH 自由基均有一定的抑制作用，其中中性酶（C ）、碱性酶（D ）、胰蛋白酶（E ）表现较优，酶解液对DPPH 自由基的清除率在70%左右，马铃薯抗氧化肽的EC 50值均较低，但存在较大差异。由于酶自身具有特异性，故对于同一种原料蛋白的作用位点不同导至所得酶解液DPPH 自由基清除率有所不同，即所得多肽的量和抗氧化活性不同。

图1各酶解液的DPPH 自由基清除率和EC 50值（改成柱状图） Fig.1 DPPH free radical scavenging effect and EC 50 of hydrolysate

6种酶在表1中列出的最适温度和pH 下，分别酶解90min 以上，所得水解物的上清液对DPPH 自由基清除率随酶解时间的变化趋势如图2所示。

图2 6种酶不同酶解时间对DPPH 自由基清除率的影响趋势

Fig.2 Influence of 6 different enzymes’ reaction time on DPPH free radical scavenging effect

由图2可以看出，随着酶解时间的增加，清除率总体呈现上升的趋势，因为酶解时间的

赵晶等的研究也发现，胰蛋白酶水解马铃薯蛋白的速度较中性酶和木瓜蛋白酶快，这说明胰蛋白酶对水解马铃薯蛋白更具有专一性[6]。本文研究的结论与赵晶等的研究结果一致，故本文选胰蛋白酶为后续研究水解用酶。

2.2 酶解试验

2.2.1 单因素试验

对选出的蛋白酶进一步研究酶解时间、底物浓度和加酶量对酶解效果的影响。

（1） 酶解时间对酶解效果的影响

在底物浓度5%、加酶量5%、pH8.0、温度50℃条件下进行酶解反应，酶解时间对酶解液DPPH自由基清除率的影响结果如图3所示。

图3 酶解时间对酶解液DPPH自由基清除率的影响

Fig.3 Influence of reaction time on DPPH free radical scavenging effect 由图3可以看出，随着酶解时间的延长清除率先是快速上升然后趋于平缓最后逐渐下降，因为随着酶解时间的延长，产生的活性肽增加，底物减少，并出现产物抑制作用，使反应动力下降，速率减小，导致30min之后DPPH的抑制率变的平缓；当时间进一步延长125min，部分多肽被降解，故水解物的抗氧化活性略有下降。

图4 底物浓度对酶解液DPPH自由基清除率的影响

Fig.4 Influence of protein concentration on DPPH free radical scavenging effect

（2） 底物浓度对酶解效果的影响

在加酶量5%、pH8.0、温度50℃的条件下，进行酶解反应90min ，底物浓度对酶解液DPPH 自由基清除率的影响如图4所示。

由图4可以看出，随着底物浓度的增加DPPH 自由基清除率呈现先上升后平缓的趋势，在底物浓度为4g/100ml 以后增长平缓甚至出现下降。在浓度较低时，酶相对过量，底物浓度的增大会加大酶与底物的结合，酶能够充分发挥作用，同时底物浓度的增加可以将反应平衡右移，使产物增加。但随着底物浓度的加大，酶量不再充足，反应动力变弱；另外料液粘度增大，使搅拌速率降低，传热传质能力降低，所以酶解物对DPPH 清除率的增加不显著。 （3） 加酶量对酶解效果的影响

在底物浓度5%、pH8.0、温度50℃的条件下，酶解90min ，加酶量对酶解液DPPH 自由基清除率的影响结果如图5所示。

图5 加酶量([E]/[S])对酶解液DPPH 自由基清除率的影响

Fig.5 Influence of enzyme concentration ([E]/[S]) on DPPH free radical scavenging effect

由图5可以看出，随着加酶量的增大，酶解液的DPPH 自由基清除率呈上升趋势，最初2%时清除率增加速度较高，但加酶量大于2%后，清除率均在55%～70%间波动。酶浓度越大，越能充分利用底物，生成的肽段越多，然而随着加酶量增加底物浓度相对逐渐减小直至底物不足，当酶浓度进一步增大，出现抗氧化活性长肽链被降解，清除率下降。 2.2.2 正交试验结果与分析

根据单因素所选取的酶解时间、底物浓度、加酶量，进行三因素三水平正交试验，试验设计如表2所示；以上清液稀释20倍测定其DPPH 自由基清除率为检测指标，结果如表3所示。

表2正交试验水平设计

Tab.2 Orthogonal experiment scheme

因素

水平

A 时间(min)

B 底物浓度(g/100ml)

C 加酶量(%)

E

空白列 1 60 4 6 2 90 5 7 3 120

5

4

表3 L 9（34）正交试验直观分析表

Tab.3 Results of L 9（34）orthogonal experiment intuitional analysis

因素

试验号

A B C D

对DPPH 清

除率（%） 1 1 1 1 1 51.2

3 1 3 3 3 49.5

4 2 1 2 3 .3

5 2 2 3 1 53.3

6 2 3 1 2 53.8

7 3 1 3 2 57.8

8 3 2 1 3 50.7

9 3 3 2 1 58.5

均值1 50.867 57.767 51.900 54.333

均值2 57.133 51.967 58.233 54.500

均值3 55.667 53.933 53.533 54.833

极差 6.266 5.800 6.333 0.500

利用正交设计助手软件分析，得到胰蛋白酶最优酶解条件组合为A2B1C2，即酶解时间90分钟、底物浓度4g/100ml、加酶量7%，即第4组组合，重复第4组试验得到清除率为72%。

2.2.3 最优条件下EC50值的确定

采用胰蛋白酶在最佳酶解工艺条件下酶解马铃薯蛋白，对酶解液固形物浓度与清除率之间试验数值关系进行方程回归，由图6可以得到酶解物的EC50值为0.155 g/100ml。

图6 最优条件下大米抗氧化肽的EC50值

Fig.6 EC50 of rice antioxidant on optimal experimental condition

3 结论

（1）木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶等六种商业蛋白酶中后三种被用于马铃薯蛋白酶解时，其酶解液具有较高的DPPH自由基清除活性，其中胰蛋白酶是酶解效果最佳的蛋白酶。

（2）马铃薯蛋白胰蛋白酶催化法制备抗氧化肽的最佳酶解反应条件为：底物浓度4g/100ml、加酶量 7%、酶解时间90min，酶解液稀释20倍后对DPPH自由基的清除率为72.0%，酶解液清除DPPH自由基的EC50为0.155g/100ml。

参考文献

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