Septin9基因甲基化DNA检测方法在结直肠癌筛查中的诊断价值

筛查中的诊断价值

黎阳惠凌云、王亚文

(1.西安交通大学第一附属医院检验科，陕西西安，710061;2.西安市中心医院检验科，陕西西安，710003;

3.西安交通大学第一附属医院生物样本信息资源中心，陕西西安，710061)

摘要：目的评价外周血Septin9基因（SEPT9)曱基化DNA检测方法在结直肠癌（CRC)筛查中的诊断价值。方法收集72例结 直肠癌患者作为病例组，61例非结直肠癌患者和健康人群作为对照组。以结直肠镜病理诊断为金标准进行确诊，同时进行 血浆SEPT9曱基化检测和粪便潜血试验(FOBT)。比较SEPT9与FOBT以及二者联合诊断的灵敏度和特异度及ROC曲线下 面积。结果SEPT9诊断病例组阳性率为81.94%，对照组阳性率为16.39%，差异具有统计学意义(P<0.05);SEPT9曱基化检测 结直肠癌的灵敏度和特异度分别为81.94%及83.61%;SEPT9和FOBT联合诊断结直肠癌的灵敏度和特异度分别为93.06% 及77.05%;ROC曲线下面积：SEPT9和FOBT分别为0.828和0.674,而二者联合检测为0.851。结论外周血SEPT9曱基化检 测是CRC早期诊断的有效方法，SEPT9和FOBT联合检测可以提高诊断效能。

关键词：结直肠癌；Septin9基因；曱基化

中图分类号：R735.2 文献标志码：A文章编号：2096-1413(2018)07-0001-03

Diagnostic evaluation of Septin9 methylated DNA detection in the screening of

colorectal cancer

LI Yang1'2, HUI Ling-yun1, WANG Ya-wen1'3'3

(1. Clinical Laboratory Department, the First Affiliated Hospital of X i'an Jiaotong University, Xi'an 710061; 2. Clinical

Laboratory Department, Xi'an Central Hospital, Xi'an 710003; 3. Biobank, the First Affiliated Hospital of X i'an Jiaotong

University, Xi'an 710061, China)

ABSTRACT: Objective To evaluate the diagnostic value of peripheral blood Septin9 gene (SEPT9) methylated DNA in col­orectal cancer(CRC)screening.Methods A total of72 cases of colorectal cancer patients were set as case group and61 cas­es of non-colorectal cancer patients or healthy persons were set as control group.The definite diagnosis was made by the pathological diagnosis whcih was as the gold standard,and plasma SEPT9 methylation detection and FOBT were performed simultaneously.The sensitivity and specificity of the SEPT9, FOBT and the combination diagnosis of above two methods were compared and the areas under ROC curve were statistically analyzed.Results The positive rate of SEPT9 in the case group was 81.94%, and it was 16.39% in the control group,the difference was statistically significant(P<0.05). The sensitivity and specificity of SEPT9 methylation in colorectal cancer were 81.94% and 83.61% respectively.The sensitivity and specificity of SEPT9 and FOBT combined diagnosis in colorectal cancer were 93.06% and 77.05% respectively.The under-ROC curve areas of SEPT9 and FOBT were0.828 and0.674; however,the area under ROC curve of SEPT9 and FOBT combined diagno­sis was 0.851. Conclusion The detection of SEPT9 methylation in peripheral blood is an effective method for the early diag­nosis of CRC.Furthermore,combined detection of SEPT9 and FOBT can improve the diagnostic efficiency.

KEYWORDS: colorectal cancer;Septin9 gene;methylation

结直肠癌（colorectalcancer,CRC)是发病率位居世界第三 的恶性肿瘤，定期筛查可以早期发现，达到早期治疗甚至治愈 的目的。然而，60%~70%的患者被诊断时已发展为中晚期[1]。高 效的CRC早期筛查方法可以改善患者5年生存率，降低死亡 率[2]。目前，CRC筛查主要有粪便潜血试验(FOBT)和结直肠镜 检查。FOBT易受到食物、药物等因素的影响导致检测结果不稳 定；结直肠镜是侵入性检查，有很多检查禁忌证，需要肠道准 备且易产生肠穿孔、感染等并发症，患者依从性差，复诊困 难。甲基化的Septin9基因（mSEPT9)是CRC发生过程中早期 的特异性生物标志物，在CRC早期阶段，mSEPT9DNA即从坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周循环血液。通过检测外周血 mSEPT9DNA，可对CRC早期诊断、治疗评估、动态监测提供 依据。该方法仅需采集患者外周血10mL，患者依从性好，有利 于筛查与复诊。本研究通过对外周血mSEPT9DNA检测筛查结 直肠癌进行诊断评价，与FOBT进行对比分析，并探讨联合检 测的诊断效能，以期发现更敏感、特异的结肠癌筛查指标。

1资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年6月至12月于西安交通大学第一附属医院

DOI: 10.19347/j.cnki.2096-1413.201807001

基金项目：西安交通大学第一附属医院临床研究中心2017年的面上项目（No.XJTUlAF-CRF-2017-014)

作者简介：黎阳（1988-)，女，汉族，陕西汉中人，检验师，硕士在读。研究方向：临床检验诊断学。

* 通讯作者：王亚文，E-m ail:wangyw1269@mail.xjtu.edu.cn.

-1-2018年3月

消化内科、肿瘤内科、普外科及门诊病例133例，以结直肠镜 病理诊断为金标准将患者分为病例组和对照组。其中病例组

72例，男35例，女37例；平均年龄(63.4±9.8)岁；包括回盲部 癌3例，升结肠癌12例，横结肠癌6例，降结肠癌7例，乙状结 肠癌16例，直肠癌28例。对照组61例，男40例，女21例；平 均年龄(62.2±9.7)岁；包括结直肠其他疾病14例（息肉或腺瘤 7例、溃疡性结肠炎2例、痔疮2例、直肠神经内分泌瘤2例、直肠浅表性炎1例），结直肠外的其他部位肿瘤32例（排除结 直肠癌转移可能），健康人群15例。两组入院前均未接受手术 及放化疗治疗。两组一般资料差异不显著CP>0.05)。

1.2仪器与试剂

Septin9基因甲基化检测试剂盒(厂家:北京博尔诚科技有 限公司），采用PCR荧光探针法;FOBT检测试剂盒(厂家：四川 沃文特生物技术有限公司），采用胶体金法。ABI7500型实时荧 光定量PCR扩增仪（厂家：美国ABI公司），WWT/FA160自动 粪便处理分析系统(厂家：四川沃文特生物技术有限公司）。

1.3方法

1.3.1血样采集与制备。外周血标本由临床医护人员用一次性

真空米血器抽取受检者静脉血10mL，注入BDVacutainera EDTAIC2抗凝管，密闭送检。采集后的血样应立即处理。若不

能立即处理，应在2耀8益保存，保存时间不超过24h不得冰 冻血样。离心全血12min，离心力（1 350±150)rcf，分离血浆再 离心12min,离心力（1 350±150)rcf,再将3.5mL血浆移入圆 锥底的离心管中。血浆样本在-25耀-15益下保存不超过4周，在2耀8益存放不超过18h。

1.3.2FOBT检测。FOBT采用胶体金免疫化学法，标本要求收 集新鲜粪便，按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3DNA提取及亚硫酸盐转化。冰冻的血浆样本，置于室温 (15耀30益），融化30min。按照Septin9基因甲基化检测试剂盒 说明书操作。提取血浆游离DNA,依次进行裂解、DNA结合和洗涤、洗脱、亚硫酸盐转化与结合、洗涤、干燥、洗脱等步骤，得 到亚硫酸盐转化的DNA(Bis-DNA)。提取后的DNA若不立即 处理，可在2耀8益储存24h或-25耀-15益储存72h。

1.3.4SEPT9基因甲基化水平检测。用Septin9基因甲基化检测 试剂盒及ABI7500型实时荧光定量PCR仪进行Bis-DNA测 定，用对照样品验证PCR反应的有效性。当待测样本ACTB的C t结果臆3

2.1，Septin9的Ct臆41.0时，Septin9基因甲基化检测

结果为阳性;待测样本ACTB的Ct结果臆32.1,Septin9的Ct>41.0 或无检出（Ct无显示）时,Septin9基因甲基化检测结果为阴性；如果ACTB的C t结果>32.1,说明本次结果无效。

1.4统计学方法

本研究的所有数据均采用SPSS18.0软件进行分析，计量 资料以X±s表示，进行t检验,计数资料采用n/%表示，采用^检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。基于精确的二项式分布计算检测灵敏度、特异度以及95%置信区间（95%CI)。用ROC曲线评价SEPT9、FOBT及二者联合对CRC的诊断 价值。

2结果

2.1SEPT9与FOBT单独及联合诊断对CRC的诊断价值

SEPT9诊断病例组的阳性率为81.94% (59/72),对照组的 阳性率为16.39% (10/61),差异具有统计学意义（;字2=56.84,P< 0.01)。SEPT9检测的灵敏度和特异度分别为81.94%和83.61%, 特异度高于FOBT和联合诊断。FOBT的灵敏度为52.78%,低 于SEPT9和联合诊断，约登指数为0.348;联合诊断的灵敏度 (93.06%)最高,约登指数高于SEPT9和FOBT单独诊断。见表1。

2.2SEPT9 与FOBT的Logistic 回归分析

Logistic回归分析结果显示,SEPT9和FOBT的OR值分别

为 23.146 和 5.080 CP<0.01，表 2),表明 SEPT9 和 FOBT 均与 CRC的发生呈正相关，二者均为CRC的危险因素。

表1 SEPT9与FOBT单独及联合诊断对CRC的诊断价值

诊断试验试验结果

金标准

灵敏度特异度阳性预测阴性预测

约登指数病例组(n=72)对照组(n=61)(95%

CI)(95%CI)值（95%CI)值(95%CI)

SEPT9阳性59/81.9410/16.39

81.94(70.74-.67)83.61 (71.45-91.45)85.51 (74.50-92.46)79.69(67.42-88.33)0.656

阴性13/18.0651/83.61

FOBT阳性38/52.7811/18.03

52.78(40.73-.52)81.97(69.60-90.24)77.55(63.01-87.75)59.52(48.24-69.93)0.348

阴性34/47.2250/81.97

联合诊断阳性67/93.0614/22.95

93.06(83.86耀97.42)77.05 (.20~86.46)82.72(72.36-.90)90.38(78.20-96.41)0.701

阴性5/6.9447/77.05

表2 SEPT9与FOBT的Logistic回归分析

检验变量回归系数标准差OR P SEPT9 3.1420.46223.146<0.01 FOBT 1.6250.408 5.080<0.01

2.3SEPT9与FOBT及联合诊断的ROC曲线

ROC曲线下面积：SEPT9为0.828, FOBT为0.674,联合诊断为0.851,联合诊断价值高于SEPT9和FOBT单独诊断。见图1。

3讨论

Septin9基因是高度保守的Septin基因家族成员之一，编 码GTP结合蛋白，在细胞骨架的维持、囊泡运输、细胞分 裂及细胞凋亡中起关键作用。DNA甲基化是一种重要的表观

-2-2018年3月

遗传学修饰，Septin9基因DNA甲基化会导致该基因异常表达，引起细胞异常和癌变，具体机制可能与细胞动力发

生异常、细胞微管结构与功能改变、细胞内外物质转运障碍等有关[3]。T〇T H等的研究结果显示，CRC从I期到IV 期，SEPT9基因甲基化水平逐渐增高，而SEPT9蛋白表达水 平降低，将CRC域期细胞用DNA去甲基化试剂5-aza-2-de- oxycytidine进行逆甲基化处理，发现SEPT9基因的mRNA和

蛋白表达明显增加，表明SEPT9基因DNA发生甲基化可导 致SEPT9-mRNA和蛋白表达降低，这可能是导致CRC发生的 机制之一。

1-特异度

图1 SEPT9与FOBT及联合诊断的ROC曲线

CRC的发病机制与表观遗传学的改变密切相关，为CRC

早期诊断提供了条件[5]。AHMED等的研究结果显示，SEPT9- v2转录本启动子gamma1区域高甲基化是CRC发生的重要

标志，可通过检测该区域的甲基化程度来进行CRC的早期 筛查。已经有较多的研究结果证实，Septin9基因5’端区 CpG岛的甲基化与结直肠癌高度相关，甲基化发生率达90%以上[7]。

有研究显示，mSEPT9基因检测筛查CRC具有较高的灵 敏度和特异度，其准确性优于FOBT，便捷性优于结直肠镜，仅 需要抽取外周静脉血，患者依从性好[8]。临床研究证实，在正常 的肠黏膜上皮、病变的结肠组织、CRC组织及CRC转移过程 中，均可检测到异常的DNA甲基化[9]。

CHURCH等[10]的研究结果显示，mSEPT9基因检测筛查CRC的灵敏度为48.2%，特异度为91.5%。JIN等[11]通过对135 例CRC患者和260例非CRC患者的研究发现，mSEPT9基因 检测筛查CRC的灵敏度和特异度分别达到74.8%和87.4%。近年多项研究表明，mSEPT9基因检测筛查CRC的灵敏度为 65%耀85%，特异度为85%耀95%，最高可达99%[12]。

本研究中，mSEPT9基因检测筛查CRC的灵敏度和特异 度分别为81.94%和83.61%，阳性预测值和阴性预测值分别为 85.51%和79.69%;FOBT筛查CRC的灵敏度和特异度分别52.78%和81.97%，灵敏度显著低于mSEPT9检测。FOBT诊断 结直肠癌假阳性率较高，易受含亚铁离子的食物和药物等干扰。LIEBERMAN[13]研究表明，FO B T筛查结直肠癌的灵敏度低，且肿瘤位置影响检测结果，对左半结肠癌高于右半结肠癌。在L ogistic回归分析中发现，二者均与C R C的发生密切相关，mSEPT9 的OR 值为 23.146。

m SEPT9基因检测的曲线下面积为0.828，远大于FOBT。二者联合诊断筛查C R C的灵敏度和特异度分别为93.06%和 77.05%，阳性预测值和阴性预测值分别为82.72%和90.38%，R O C曲线下面积达到0.851，高于m SEPT9基因和FO B T单独检测，具有更高的筛查效能。Y A N等[14]的研究显示，m SEPT9检测 和FO B T筛查C R C的灵敏度分别为66%和60%，两者联合诊 断灵敏度可达88.7%，有助于提高C R C诊断准确性，与本研究 结果一致。

综上所述，m SEPT9基因检测在C R C诊断中具有准确性高、取样方便且无创、检测快速等优点，与FO B T联合应用能提 高C R C的诊断效能，可在结直肠癌早期筛查中作为临床实践 的新方案。

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