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收稿日期:2009211214　修回日期:2010201226

幽门螺杆菌感染的检测方法

熊兴波1△(综述),杜国平2※(审校)

(1.广东医学院,广东湛江524023; 2.佛山市顺德区第一人民医院消化内科,广东佛山528300)中图分类号:R446.5　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:100622084(2010)0620931204

　　摘要:幽门螺杆菌(HP)感染的检测方法包括侵入性及非侵入性检测方法。侵入性法主要有HP培养、胃黏膜直接涂片革兰染色镜检、胃黏膜组织切片染色镜检、快速尿素酶试验、分子生物学方法等;而非侵入性法主要包括13C或14C尿素呼气试验、15N尿氨排泄试验、粪便HP抗原检测、HP抗体检测等;生物芯片检测技术在HP耐药基因的检测、HP抗原检测及蛋白纯化等方面也取得了一定的进展。

关键词:幽门螺杆菌;检测;侵入性;非侵入性;诊断

D etecti on A ss ays of Heli cobacter Pylor i I nfecti on　X I ON G X ing2bo1,DU Guo2ping2.(1.Guangdong M edical

College,Zhanjiang524023,China;2.D epart m ent of D igestive Internal M edicine,the First People′s Hospital of Shunde,Foshan528300,China)

Abstract:The detecti on assays of HP infecti on include invasive and non2invasive detecti on assays.I nvasive detecti on assays include:HP culture,gastric direct s mear Gra m staining,gastric mucosa bi op sy staining,rap id ure2 ase test,molecular bi ol ogy methods;and non2invasive detecti on methods include:13C or14C urea breathing test, 15N a mmonia excreti on of urine tests,HP st ool antigen test,HP antibody test;HP bi o2chi p detecti on techniques have als o made s o me pr ogress in detecti ons of HP resisitance genes,detecti ons of HP antigens and pr oteins purificati on.

Key words:Helicobacter pyl ori;Detecti on;I nvasive;Non2invasive;D iagnosis

　　自1983年澳大利亚学者BarryMarshall和Robin

W arren首次从胃炎患者胃黏膜中分离出幽门螺杆菌

(Helicobacter pyl ori,HP)以来,诸多研究证实,HP感

染不但是慢性胃炎与消化性溃疡的主要致病因素,而且与胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤,以及一些胃肠外疾病密切相关。1996年,WHO将HP列入人类五大生物致癌因素之一。因此,特异、敏感地检测HP是对胃内外疾病的早期预防、综合治疗和防止复发具有重要意义[1]。HP 感染的检测一般依据对

人体有无创伤分为侵入性和非侵入性诊断方法。现就HP感染的诊断方法综述如下。

1　HP感染的侵入性检查方法

1.1　HP培养　HP对营养要求高且为微需氧细菌,大气下及厌氧条件下不能生存,可选用Skirr o w选择性培养基、布氏肉汤琼脂基础、巧克力培养基等营养丰富的培养基础,以含血脑心浸液卵黄琼脂培养基效果最佳,添加5%～10%冻融脱纤维羊血和选择性抗生素如Skirr ow选择性抗生素,在微需氧条件下培养3～5d,观察有无针尖样0.1～1mm的透明或半透明湿润菌落。涂片暗视野观察可见典型的弯曲样杆菌,可有弱动力,培养时间长,易发生球形变,为革兰染色阴性的易球形变的弯曲形杆菌,尿素酶、氧化酶及过氧化氢酶等试验阳性可确定为HP[3]。此法是HP感染诊断的“金标准”,HP培养所需费用高,费时较长,一般只用于科研工作,在临床特别是基层医院不易推广。

1.2　胃黏膜涂片革兰染色镜检　此法将活检胃黏膜标本的黏膜面在干净玻片上涂抹成5～10mm直径大小的涂片,晾干或火焰固定后行革兰染色,油镜下观察涂片的细菌形态和数量,有无典型的弯曲形或螺旋形细菌,可迅速确定有无HP感染。由于涂片是将HP主要定植部位的黏膜或黏液进行观察,阳性率很高,是经济、准确和较快速的诊断方法,适合行胃镜检查而未开展快速尿素酶试验(rap id urease test,RUT)的单位进行。

1.3　组织切片染色镜检　HP具有典型的形态特点,在胃黏膜上一般呈典型的“S”形弯曲、“C”形或“海鸥状”。通过胃镜检查时胃黏膜取材,包埋切片染色镜检进行组织形态上HP检测。目前以W ar2 rhin2Starry银染色效果最佳,细菌清晰易辨,但费时且需一定技术,临床中常用改良Gie m sa或甲苯胺兰染色,该方法较简便,效果也较好。组织学诊断HP 的优点是可以同时进行胃黏膜的病理学诊断且特异性较高,但HP在胃中的分布不均,敏感性稍低。因此取活检部位及数目,非连续3点取材时可避免漏诊,另外HP治疗后定植有上移现象,即当治疗后胃窦阴性而胃体可呈阳性,应同时在胃窦和胃体取至少2块标本[4]。

1.4　RUT　临床上侵入性检测中诊断HP感染的首选方法,原理是HP具有丰富的尿素酶,分解尿素产生氨和二氧化碳,氨使反应系变成碱性,由pH指示剂显色,特别适于基层医疗单位开展,其诊断HP的准确性与组织病理切片相当,但由于RUT法一般于胃窦处取材,取材受“灶性”分布的影响,且对于HP 治疗后定植上移的受检者会出现假阴性的结果,所以该法一般不能用于HP根除效果的评价。何亚龙等[5]通过对5种HP检测方法比较,提示RUT检测方法简单,费用低,但灵敏度和特异性不是很高,并提示13C2UBT检测HP感染的敏感性、特异性和RUT 比较有统计学意义。但与尿素呼气试验(urea breathing test,UBT)相比,Ada mopoul os等[6]报道,在评价B illr othⅡ式胃大切患者HP感染方面,胃底活检RUT检测结果可靠,而UBT检测结果不可靠。1.5　分子生物学方法

1.5.1　聚合酶链反应(poly merase chain reacti on, PCR)法　PCR是检测HP最敏感的技术,简便、快捷、特异性强,且对原材料的要求低,除新鲜活检标本外,可检测唾液、胃液,石蜡包埋和已做过RUT的标本也可应用,并可对粪便和环境中的HP DNA进行检测。但已被抗生素杀死而仍存留胃中的HP DNA,也会被扩增出现阳性结果。PCR技术要求高,而且由于其高度的敏感性,易受器械或标本的污染而出现假阳性,故不宜作为常规诊断手段。但PCR 对HP毒力菌株的鉴定及分型、耐药基因检测及流行病学的研究具有重要的诊断价值。H irai等[7]用免疫层析法检测无症状日本人群粪便标本中的HP抗原,用基因型特异性引物对进行巢式PCR,以及用实时PCR检测粪便标本中提取的HP DNA的16S r RNA 基因来确诊。无症状的日本人HP的感染率为37.5%,毒力因子细胞毒素相关基因A(cyt ot oxin as2 s ociated gene A,Cag A)基因的检测率为18.8%,均属于高毒力的东亚类型。PCR在无症状人群HP感染的分子流行病学研究中是有价值的。Woo等[8]用双引物寡核苷酸为基础的多重PCR检测HP23S r RNA 基因的点突变而导致的HP对克拉霉素的耐药。在表型药敏试验及双引物寡核苷酸为基础的多重PCR 检测结果中,有94.1%是一致的,说明双引物寡核苷酸为基础的多重PCR检测是一种实用的检测HP克拉霉素耐药性的方法。

1.5.2　反转录酶2PCR　该法是以HP DNA转录的RNA为模板,在反转录酶的作用下重新合成DNA,通过对合成的DNA进行PCR扩增,从而判断原有的标本是否存在HP RNA及其RNA水平的活性。

PCR及反转录酶2PCR技术要求高,且具有高敏感性,临床标本易污染,使其临床应用受到,应该严格设置阳性和阴性对照保证其检测结果的可靠性,主要用于科研目的。

2　非侵入性检测方法

2.1　UBT　原理是HP在体内产生尿素酶,用13C 或14C同位素标记尿素口服后可被HP产生的尿素酶分解,产生13CO

2

或14CO

2

"c":

的Δ13CO

2值显著高于13C2UBT的Δ13CO

2

值,胃内样

本的最大敏感度和特异度分别为97%和100%,而20m in后呼气样本的敏感度和特异度分别为71.4%和66.7%,提示对于胃部分切除患者HP检测,内镜13C2UBT比标准13C2UBT更好。

2.2　15N尿氨排出试验　患者口服稳定同位素15N 标记的尿素后,收集2h尿液,用质谱法检测尿中15 N2氨的排出率,以判断胃内HP的感染程度。此法具有13C2UBT同样的优缺点。15N2尿氨排出试验是一种检测15N2尿素在胃内分解后,15N2氨经吸收通过肾脏由尿液排出的试验,肝脏是氨的主要代谢器官,因此有严重肝肾功能损害者不宜使用[11]。

2.3　粪便HP抗原检测　HP粪便抗原(Helicobacter pyl ori st ool antigen,HPS A)检测试验,是一种非侵入性诊断方法。由于HP定居于胃上皮细胞表面,随着胃黏膜上皮细胞的快速更新脱落,HP也随之脱落,并通过胃肠道从粪便排出,从而可以通过粪便来检测HP。HP粪便抗原检测试验能够特异性诊断人体内HP的感染,同时可适用于婴幼儿以及有精神障碍的患者,该方法操作简便、省时,不需要昂贵的仪器。石国范等[12]通过HPS A快速免疫检测卡检测患者的粪便标本,以RUT、病理组织学染色、13C2UBT联合检测结果作为“金标准”评价HPS A检测在抗HP治疗前后的准确性。抗HP治疗前及抗HP治疗后HPS A 检测的敏感度分别为92.9%、90.0%;特异度为94.4%、94.8%;阳性预测值为95.9%、85.7%;阴性预测值为90.4%、96.5%;准确度为9

3.5%、93.5%,说明HPS A快速检测卡试验对抗HP感染诊疗前后均有较高的准确性。Nguyen等[13]研究3～15岁的越南儿童,结果232例HP培养阳性的患儿,HPS A阳性为224例,而98例血清学HP阴性的儿童,HPS A阴性为93例。HPS A诊断敏感度96.6%,特异度为9

4.9%,提示HPS A是检测HP感染的可靠方法。2.4　HP抗体检测

2.4.1　血清学抗体检测　该方法是非现症感染检测方法,可反映一段时间内HP的感染情况,不受近期用药的影响,但不能完全反映HP的现症感染情况。由于HP感染一般都不能自行消失,如未经抗HP治疗,HP抗体阳性即提示有HP现症感染。一般选用HP全菌抗原和纯化的组分特异抗原检测血中的抗HP I gG和I g M抗体。目前主要有酶联免疫吸附试验、免疫印迹试验应用于HP感染的诊断与研究。血清学方法不需通过内镜取材,具有快速、简便、易于操作、重复性好、成本低等优点,且通过血清学试验检测Cag A I gG抗体还可检出HP毒力菌株,但有文献报道其检测存在局限性[14]。其缺点是因抗HP I gG可长期存在,试验阳性只表明曾感染过HP,不能鉴别既往感染及现疫患者。Leal等[15]对检测抗体为基础的HP感染检测方法进行荟萃分析发现,免疫印迹方法具有高度敏感度(91.3%)和特异度(%);酶联免疫吸附试验2I gG法具有较低的敏感度(79.2%)和较高的特异度(92.4%);全细胞抗原酶联免疫吸附试验具有最高的敏感度(94.5%)和最高的特异度(96.4%)。目前尚有血清HP可溶性抗原检测方法,即HP小分子可溶性抗原可在HP感染时进入血循环,血清中可溶性抗原的检测可以用于HP现症感染的诊断。在2005年欧洲马斯特里赫特3共识意见中,认为对于检测准确性高的HP现症感染的血清学检测方法,可以用于HP现症感染的检测,其推荐等级为B级。W ang等[16]用13C尿素呼气试验为标准评价现症感染条带在治疗前和HP根除治疗后对检测HP感染的价值,研究证实了现症感染条带检测是一种简单、快速、准确、价格低廉、人性化的检测方法,在行HP根除前此法能检测HP现症感染并得到满意的效果,但在抗HP治疗6个月内此法检测不能准确区分既往还是现症感染。

2.4.2　尿液抗体检测　尿液抗HP抗体检测是非侵入性诊断方法,主要特点是不需要使用胃镜,无创伤性,避免患者反复作胃镜的痛苦及胃镜检查中可能存在的医源性感染,具有准确、简便、易行的特点,容易为患者接受,尤其适用于流行病学调研和临床应用。测定方法有酶联免疫吸附试验、乳凝聚试验、蛋白印迹等。

3　HP的生物芯片检测

3.1　HP的DNA芯片检测　可以针对HP的全基因组或某些特定基因进行设计,发挥高通量分析的优势,可以对HP的标识基因、毒力基因等进行快速、大规模筛查,从而为菌种鉴定、基因分型、细菌耐药研究等提供高效快捷的技术手段,能够对相关菌株特征在基因水平上有更全面的了解。目前在HP耐药基因检测方面研究较多。Chen等[17]用寡核苷酸芯片检测HP耐克拉霉素相关23S r RNA基因点突变(142A→G,2143A→G和2182C→T),相关的基因突变通过基因测序来证实,检测标本中无2142A→G突变,2143A→G、2182C→T突变率分别为11.11%和12.96%,与基因测序结果完全一致。研究证明,寡核苷酸芯片技术提供了快速准确的检测HP23S r RNA单核苷酸多态性,可以将此杂交技术用于临床的诊断与治疗。Xuan等[18]用酶比色为基础的DNA 芯片来分析23S r RNA基因单核苷酸多态性,研究证实了比色DNA芯片能准确快速检测胃组织HP克拉霉素耐药相关性23S r RNA基因突变。

3.2　HP的蛋白芯片检测　HP蛋白芯片的组成特点,就是具体的诊断或分析目的,将多种HP蛋白或对应的抗体成分,分别固定在芯片片基上,以达到同步检测多重HP抗原或抗体成分的目的。孙艳艳等[19]用蛋白芯片技术检测300例患者血清中Cag A、尿素酶和空泡细胞毒素3种抗体,结果蛋白芯片方法诊断HP感染的敏感度为92.5%、特异度为41.3%、总符合率为73.5%、阳性预测值为72.8%、阴性预测值为76.5%。Khoder等[20]用高通量电离飞行时间质谱分离HP蛋白,用非参数检验方法从2个临床结果中筛选出18个有统计学意义的候选生物标志,纯化了其中3个生物标志蛋白,分别是:

①中性粒细胞激活蛋白NapA(HU HP AG1_0821);

②RNA结合蛋白(HP AG1_0813);③DNA结合蛋白样蛋白(HU jhp0228)。这些新的生物标志利于HP 感染患者诊断学方法的发展及预测胃癌的演变情况。

总之,HP感染的检测应根据不同的检测目的,选择不同的检测方法。细菌培养、分子生物学、生物芯片检测方法主要用于科研及流行病的调查。细菌培养是检测的“金标准”,但费时长;分子生物学、生物芯片检测方法在菌种鉴定、基因分型、细菌耐药等研究中起到重要作用,但由于其高度敏感性及技术要求高,在临床中的应用受到;血清学及尿液抗体检测方法在流行病的调查中常用,能反映既往感染情况,一般不用于现症感染的评价。临床中常用的检测方法有RUT、UBT及粪便HP检测。RUT是侵入性检测中诊断HP感染的首选方法,该方法简单、费用低,但灵敏度和特异性不是很高;UBT是非侵入性HP感染诊断的“金标准”,但其费用较高,适用于抗HP治疗后疗效的评价;粪便HP检测适用于婴幼儿以及有精神障碍的患者,敏感度及特异度均较高,是HP感染非侵入性检测方法的又一理想选择。

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收稿日期:2009210216　修回日期:2010201214