小鼠CD226( PTA1)的基因克隆及其异型①

小鼠CD226(PTA1)的基因克隆及其异型①

张新海　李德敏　欧阳为明　贾　卫　谢　鑫　陈丽华　宁双飞　张　　　金伯泉

(第四军医大学免疫学教研室,西安710032)

　　中国图书分类号　R392　Q781　　文献标识码　A　　文章编号　10002484X(2002)0620371205

摘　要　目的:克隆小鼠C D226(PT A1)分子。方法:从G enBank中检索出与人C D226分子在氨基酸水平上有51%同源性的EST序列,设计并合成特异性引物,采用快速扩增cDNA末端的RACE方法,从4周龄BA LBΠc小鼠的胸腺中扩增小鼠C D226 cDNA序列。结果:克隆出完整的小鼠C D226cDNA,长2223bp,其中开放读框为1002bp,编码含信号肽在内的333个氨基酸,属免疫球蛋白超家族分子,较人C D226分子少了3个氨基酸,在氨基酸水平上有53%的同源性。此外,还克隆了小鼠C D226分子的3种异型。结论:成功克隆出小鼠C D226(PT A1)cDNA,并发现3种异型,全面探讨该分子生物学特性,进行体内功能实验,基因敲除小鼠和转基因小鼠的研究提供了坚实的基础。

关键词　C D226　血小板ΠT细胞活化抗原1　小鼠　基因克隆　异型

Molecular cloning of mouse CD226(PTA1)and its isoforms

ZH ANG Xin2Hai,LI De2Min,OUY ANG Wei2Ming et al.Department o f Immunology,Fourth Military Medical Univer sity, Xi’an710032

Abstract　Objective:T o clone m ouse C D226(platelet and T cell activation antigen1,PT A1).Methods:S pecific primers were designed and sythesized according to the EST sequence from G enBank,which had51%hom ology to human C D226on the amino acid level.And then, the cDNA of m ouse C D226was cloned from the thymus of42week2old BA LBΠc m ouse by using RACE technique.R esults:The length of m ouse C D226cDNA is2223bp,with the open reading frame(ORF)of1002bp,encoding333amino acids,which is3amino acids shorter than its counterpart in human.The m ouse C D226belongs to IgSF,and shares53%hom ology with human PT A1on amino acid level.Besides,three is o2 forms of m ouse PT A1were als o cloned at the mean time.Conclusion:The m olecular cloning of m ouse PT A1lays the foundation for the in viv o studies on the biological function of this m olecule,as well as the studies of this m olecule in gene knockout m ouse and transgenic m ouse.

K ey w ords　C D226　Platelet and T cell activation antigen1(PT A1)　M ouse　M olecular cloning　Is oform

　　人血小板ΠT细胞活化抗原1(Platelet and T cell activation antigen1,PT A1),是1997年基因克隆成功的一个新分子1,并在2000年第七届国际人类白细胞分化抗原协作组大会上获准了新的C D编号(C D226)。自1985年发现该分子以来,对其结构、分布、功能以及与临床的关系等做了大量的研究。结果证实,C D226分子属于免疫球蛋白超家族成员,胞膜外区含有2个V样结构域;主要表达于活化T细胞、NK细胞、巨核Π血小板谱系及活化的血管内皮细胞;参与T细胞的活化与分化、血小板的活化与聚

①由国家自然科学基金重点项目(30030130),National K ey Basic Re2 search Program of China(2001C B510004)和国家自然科学基金青年项目(39900017)资助

作者简介:张新海,男,33岁,免疫学博士生,讲师;

金伯泉,男,58岁,博士生导师,主要从事细胞和分子免疫

学研究,为通讯作者。集,并参与其中的信号转导;与血小板功能异常、自身免疫性疾病、移植物抗宿主反应、病毒感染性疾病以及肿瘤等疾病的发病机制有着密切的关系。本实验室已于1997年克隆成功猿和猴的C D226分子,并证实在氨基酸水平上与人C D226分子的同源性达93%～95%2。小鼠作为最常用的实验动物,不仅为体内试验提供有用的动物模型,也是免疫分子基因敲除和转基因最常用的动物。我们根据在G en2 Bank的小鼠EST中与人C D226同源性较高的一段DNA序列,设计特异性引物,采用Clontech的快速扩增cDNA末端(RACE)试剂盒,从BA LBΠc小鼠的胸腺细胞中成功地克隆出编码小鼠C D226的全长基因,并且发现了除全长外三种不同的异型,该四条cDNA已被美国G enBank正式接收并给予相应的编号。

1　材料与方法

111　材料

11111　主要试剂　RNA提取试剂Trizol购自GI BC O 公司。用于快速扩增cDNA末端的RACE试剂盒购自Clontech公司。T aqDNA聚合酶、dNTPs购自大连宝生物公司。质粒提取、胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司。序列特异性引物由北京赛百盛公司合成。克隆基因的序列测定由上海Sang on生物工程技术服务有限公司完成。

11112　菌株、质粒和动物　大肠杆菌JM109由本室保存。克隆载体pM D182T vector购自大连宝生物公司。4周龄II级BA LBΠc小鼠由本校实验动物中心提供。

112　方法

11211　引物设计和cDNA扩增　从G enBank的EST 文库中检索出一段与人C D226在氨基酸水平有51%同源性的小鼠EST序列,编号为BE623877。根据该序列设计了如下2条特异性引物:P1:5’C AAC2 CC ACTT ATCTG C AAGG A,P2:5’ATG TCT ACCTG AT2 GGGG CTG。取4周龄BA LBΠc小鼠胸腺,使用Trizol 试剂一步法提取总RNA,按照RACE试剂盒说明书逆转录5’端和3’端的cDNA,分别以这两种cDNA为模板,采用试剂盒所提供的通用引物与P2和P1配对进行PCR,扩增5’和3’特异性cDNA。将扩增的小鼠cDNA克隆入pM D182T载体,进行序列测定。11212　扩增含有完整开放读框的cDNA　根据序列测定及拼接的小鼠全长C D226cDNA结果,由于5’端的引物P1已在起始码ATG之前,因而在终止码T AA之后设计3’端特异性引物P3(5’G ATCCT AG TG2 G T AAGG AAATC ATGG),以4周龄BA LBΠc小鼠胸腺cDNA为模板,引物P1与P3配对,扩增含有完整开放读框的小鼠C D226cDNA。

2　结果

211　小鼠C D226全长cDNA序列　采用RACE方法分别扩增出了小鼠C D226cDNA5’端和3’端的序列,经拼接后获得2223bp小鼠C D226全长cDNA(G en2 Bank接收号为AF416980)。图1、2分别列出小鼠C D226开放读框的cDNA序列及氨基酸序列,并与人、猿和猴的C D226分子进行了比较。编码完整小鼠C D226分子的cDNA开放读框有1002bp,编码333个氨基酸残基,较人、猿和猴C D226分子少3个氨基酸残基。其中,信号肽有18个氨基酸残基。胞膜外区有236个氨基酸残基,两对保守的半胱氨酸残基(Cys19和Cys91,以及Cys135和Cys206)以二硫键形成两个免疫球蛋白V样结构域,另外有6个潜在的N连接的糖基化位点(Asn2Xaa2SerΠThr),以及5个潜在的O2连接的糖基化位点(Thr或Ser)。跨膜区有21个氨基酸残基。胞浆区有58个氨基酸残基,含有5个潜在的磷酸化位点(Ser285、Ser288、Ser292、Thr293和T yr301)。此外,在胞浆区还具有高度保守的序列E DIY VNY,该序列为非受体蛋白酪氨酸激酶作用的底物,并为含有SH2结构域分子的识别位点。小鼠与人C D226在核苷酸水平有67%的同源性,而在氨基酸水平有53%的同源性。图3为小鼠C D226分子的结构模式图。

212　小鼠C D226异型的发现　我们在采用P1ΠP3引物从BA LBΠc小鼠胸腺cDNA中克隆C D226完整开放读框时,获得4条扩增产物,经测序证实一条编码完整开放读框,另3条为小鼠C D226cDNA的异型(is oforms)(G enBank接收号分别为AF421198, AF421199和AF421200)。其中,is oform1编码187个氨基酸残基,缺失了胞膜外区第二个结构域的大部分,并于跨膜区处提前终止;is oform2有220个氨基酸残基,在信号肽之后缺失了胞膜外区的第一个结构域,编码完整的第二结构域、跨膜区及胞浆区;is o2 form3编码129个氨基酸残基,在is oform2的基础上,进一步缺失信号肽区,由于移码,仅能编码胞膜外区第二结构域的一部分、跨膜区及胞浆区。这三种异型的有效表达、细胞定位及确切的生物学功能尚待进一步阐明。图4显示的是小鼠C D226全长分子及三种异型的结构。

3　讨论

人C D226分子是1985年通过单克隆抗体LeoA1而被发现的3,4,其cDNA于1997年克隆成功1,并在2000年第七届国际人类白细胞分化抗原协作组大会上获准了新的C D编号(C D226)。该分子在结构上属于免疫球蛋白超家族成员,其胞膜外区含有两个V样结构域,是目前发现的IgSF中唯一具有两个V样结构域的分子。1997年我室又成功克隆了猿和猴的C D226cDNA2,采用重导向细胞毒实验,证实C D226在NK细胞上具有刺激性受体的功能5,制备了一套能识别人C D226不同表位的单克隆抗体,由此建立了双抗体夹心E LIS A方法,并首次证实人活化外周血单个核细胞培养上清中和人血清中存在可溶性C D226分子,而且血清中可溶性

Fig.1　Comp arison of CD226cDNA ORFs among mouse,hum an,gibbon and monkey

图2　小鼠CD226与人、猿和猴氨基酸序列的比较

Fig.2　Comp arison of mouse CD226with hum an,gibbon and monkey CD226on amino acid level

C D226分子的水平与类风湿性关节炎等免疫性疾病有关6,7,证实了人C D226分子第一结构域与其功能有关,发现人C D226分子存在膜相关分子8;证实人C D226是一种新的内皮细胞可诱导性表达的粘附分子9,应用PT A1ΠIg融合蛋白进行免疫荧光染色,发现在人内皮细胞、肾细胞、成纤维细胞、胃癌细胞等多种细胞系有不同程度C D226配体的表达,其分子量约为220kD。

小鼠不仅为体内试验常用的动物模型,也是免疫分子基因敲除和转基因研究最为常用的动物。本文应用生物信息学方法,从G enBank中查寻出一段小鼠EST序列,在氨基酸水平上与人C D226有51%的同源性。以此序列为基础设计了特异性引物,采用RACE方法,从BA LBΠc小鼠的胸腺中成功地克隆了小鼠C D226分子的全长cDNA。

在氨基酸水平上,小鼠与人C D226分子具有

图3　小鼠CD226分子的结构模式图

Fig.3　Structure of mouse

CD226

图4　小鼠CD226全长分子及三种异型的结构特点

Fig.4　Structure of mouse CD226wild type and chree isoforms

N ote :S.S ignal sequence ;D1.First domain of extracellular region ;D2.Second

domain of extracellular region ;T M.T ransmembrane region ;C.Cytoplas 2mic region.

53%的同源性,而且形成二硫键的4个半胱氨酸高

度保守,保留了免疫球蛋白V 样结构域的特征性结

构(Asp 2Xaa 2G ly ΠAla 2Xaa 2Try 2Xaa 2Cys )。此外,其胞膜外区还有6个N 2链接的糖基化位点和5个O 2连接的糖基化位点。在胞浆区,具有结合含有SH2结构

域分子的E DIY VNY 序列亦是高度保守的。说明小

鼠C D226分子有较高的保守性。在克隆小鼠C D226全部开放读框的过程中,我们又克隆出了另外三种异型。一个分子具有多种异型的现象并不少见,这主要是由于mRNA 的不同剪切所形成的,而不同的异型往往具有其特殊的生物学功能。在本研究中发现的小鼠C D226的三种不同剪切形式,是否能有效地表达,以及其生物学意义如何,有待于在进一步的研究中加以证实。

小鼠C D226(PT A1)基因的克隆成功,为全面探讨该分子的生物学特性、寻找配体及相关作用分子,开展C D226体内实验,以及基因敲除小鼠和转基因小鼠等的研究提供了坚实的基础。

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[收稿2001212208(编辑　张　慧)