一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610911305.7

(22)申请日 2016.10.19

(71)申请人 珠海丽珠试剂股份有限公司

地址 519000 广东省珠海市南屏科技工业

园屏东三路一号珠海丽珠试剂有限公

司

(72)发明人 邓京　欧格　

(74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司

44202

代理人 温旭

(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)

(54)发明名称一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法(57)摘要本发明公开了一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法，属于生物技术领域。本发明的冻干保护剂包括海藻糖、聚蔗糖和水，所述冻干保护剂是将海藻糖6.4～16.0g、聚蔗糖0.4～1.0g混合并加水至40ml制成的。本发明还提供了一种RNA扩增反应试剂的冻干方法，包括以下步骤：a、将冻干保护剂与实时荧光RT-PCR反应试剂混合均匀，得到实时荧光RT-PCR反应液；b、将RT-PCR反应液进行冷冻干燥，即得到RT-PCR冻干试剂。本发明所述的冻干保护剂及冻干方法能使RNA荧光定量PCR反应试剂能在2～8℃甚至室温

稳定长时间存放。权利要求书1页 说明书9页 附图3页CN 106591432 A 2017.04.26

C N 106591432

A

1.一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂，其特征在于：包括海藻糖、聚蔗糖和水。

2.根据权利要求1所述的RNA扩增反应试剂的冻干保护剂，其特征在于：所述冻干保护剂是将海藻糖6.4～16.0g、聚蔗糖0.4～1.0g混合并加水至40ml制成的。

3.根据权利要求2所述的RNA扩增反应试剂的冻干保护剂，其特征在于：所述海藻糖与聚蔗糖的配比为16g：1g，加水至40ml。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的RNA扩增反应试剂的冻干保护剂，其特征在于：所述聚蔗糖为Ficoll400。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的RNA扩增反应试剂的冻干保护剂，其特征在于：所述水为超纯水或不含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的经过DEPC处理的纯净水。

6.一种制备如权利要求1～3中任一项所述冻干保护剂的方法，其特征在于：按比例称取海藻糖、聚蔗糖和水，置于容器内混合，然后置于水浴锅内在50～60℃条件下水浴5～15min使其溶解，混合均匀，小支分装，放入2～8℃冰箱保存即可。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：按比例称取海藻糖、聚蔗糖和水，置于离心管内混合，然后置于水浴锅内在60℃条件下水浴10min使其溶解，混合均匀后小支分装，放入2～8℃冰箱保存即可。

8.一种RNA扩增反应试剂的冻干方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、将权利要求1～3中任一项所述的冻干保护剂与实时荧光RT-PCR反应试剂混合均匀，得到实时荧光RT-PCR反应液；

b、将RT-PCR反应液进行冷冻干燥，即得到RT-PCR冻干试剂。

9.根据权利要求8所述的冻干方法，其特征在于：所述步骤a中海藻糖在实时荧光RT-PCR反应液中的终浓度为4～10％，聚蔗糖在实时荧光RT-PCR反应液中的终浓度为0.25～0.625％。

10.根据权利要求8所述的冻干方法，其特征在于：所述步骤b中的冻干条件为：预冻阶段经过1h，隔板温度下降到-45±2℃、预冻时低温保持时间为2h；主干燥阶段首先用40min 抽真空至0.16mbar、再用60min将隔板温度升至-25±2℃，然后保持4h；解析干燥阶段首先用60～120min抽真空至0.01mbar，再用60～90min将隔板温度升至25±2℃并保持2h，然后用20min将隔板温度升至35℃并保持4h，最后用20min将隔板温度降至25℃并保持2h。

权　利　要　求　书1/1页CN 106591432 A

技术领域

[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法。

背景技术

[0002]实时荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。实时荧光定量PCR技术具有快速、特异、灵敏等特点。

[0003]近年来，实时荧光定量PCR试剂广泛应用在食品检测、病原体检测和癌基因诊断等方面。但荧光定量PCR试剂在保存和运输条件上要求苛刻，一般需要保存在-20℃并且对溶液冻融次数有，普遍需要干冰运输。这些条件如果得不到满足，会对PCR试剂的性能尤其是灵敏度造成很大的影响，甚至导致试剂失效。

[0004]对应用于RNA的PCR试剂，体系内需包括逆转录酶对RNA把序列逆转录成DNA作为模板再进行PCR扩增，逆转录酶的最适工作温度约为37℃～60℃，相对工作温度94℃的DNA聚合酶的来说对温度更敏感，因此RNA类PCR检测试剂对保存温度更为敏感。

[0005]冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使固态水直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。冷冻干燥在低温下进行，因此对于许多热敏性的物质特别适用。试剂冻干后，排除95％的水份，而蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力，干燥后的产品能够常温保存而不致变质，因此冷冻干燥技术在医药上得到广泛地应用。

发明内容

[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法，能使RNA荧光定量PCR反应试剂能在2～8℃甚至室温稳定长时间存放。[0007]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

[0008]一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂，其包括海藻糖、聚蔗糖和水。

[0009]作为本发明优选的实施方案，所述冻干保护剂是将海藻糖6.4～16.0g、聚蔗糖0.4～1.0g混合并加水至40ml制成的。

[0010]作为本发明更优选的实施方案，所述海藻糖与聚蔗糖的配比为16g：1g，加水至40ml。

[0011]具体地，所述聚蔗糖为Ficoll400。

[0012]优选地，所述水为超纯水或不含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的经过DEPC处理的纯净水。

[0013]本发明还提供了一种制备如上所述冻干保护剂的方法，其步骤如下：按比例称取海藻糖、聚蔗糖和水，置于容器内混合，然后置于水浴锅内在50～60℃条件下水浴5～15min 使其溶解，混合均匀，小支分装，放入2～8℃冰箱保存即可。

[0014]作为本发明优选的实施方案，按比例称取海藻糖、聚蔗糖和水，置于离心管内混合，然后置于水浴锅内在60℃条件下水浴10min使其溶解，混合均匀后小支分装，放入2～8℃冰箱保存即可。

[0015]本发明还提供了一种RNA扩增反应试剂的冻干方法，其包括以下步骤：

[0016]a、将上述的冻干保护剂与实时荧光RT-PCR反应试剂混合均匀，得到实时荧光RT-PCR反应液；

[0017]b、将RT-PCR反应液进行冷冻干燥，即得到RT-PCR冻干试剂。

[0018]作为本发明优选的实施方案，所述步骤a中海藻糖在实时荧光RT-PCR反应液中的终浓度为4～10％，聚蔗糖在实时荧光RT-PCR反应液中的终浓度为0.25～0.625％。[0019]所述其中实时荧光RT-PCR反应试剂是一种水溶液，包含如下溶质：Tris·HCl、KCL、(NH4)2·SO4、Mn2+、Tth酶、dNTPs、引物和探针等。

[0020]作为本发明优选的实施方案，所述步骤b中的冻干条件为：预冻阶段经过1h，隔板温度下降到-45±2℃、预冻时低温保持时间为2h；主干燥阶段首先用40min抽真空至0.16mbar、再用60min将隔板温度升至-25±2℃，然后保持4h；解析干燥阶段首先用60～120min抽真空至0.01mbar，再用60～90min将隔板温度升至25±2℃并保持2h，然后用20min 将隔板温度升至35℃并保持4h，最后用20min将隔板温度降至25℃并保持2h。

[0021]在本发明中，海藻糖是由特殊双糖分子构成的非还原糖，易溶于水，在水中的溶解度随温度变化较为明显；具有很高的玻璃化转变温度；内部氢键少，结构稳定，具有极强的耐热、耐酸性，是很多生物活性物质的稳定剂。海藻糖还有保护蛋白质结构稳定的作用，因为它富含羟基，可以在蛋白质周围形成类似水化膜的结构，使蛋白质的结构在失水条件下保持稳定。聚蔗糖为蔗糖与环氧氯丙烷的聚合物、蔗糖与氯甲基环氧乙烷的聚合物，聚蔗糖所形成的保护层可以疫苗对酶的降解更有抵抗力，也可以玻璃化保护。

[0022]相比现有技术，本发明的有益效果在于：

[0023]本发明所述的RNA扩增反应试剂的冻干保护剂采用的冻干填料具有保护生物制品的活性的作用，还有维持冻干过程中试剂的稳定性的作用，此外，此冻干保护剂成本低，操作方便，可以用于大规模生产。应用本发明的冻干保护剂冻干RNA扩增反应试剂，在37℃加速考核15日，敏感性仍可保持稳定；冻干后的试剂制品能够在2-8℃或者室温下长期保存，而不影响性能，大大降低了目前现有的RNA扩增反应试剂保存和运输的要求以及成本，冻干试剂不受冻融次数的，提高试剂使用的便利性。

附图说明

[0024]图1为本发明实施例1中HCV-PCR冻干试剂冻干后的外观；

[0025]图2为本发明实施例1中对照组HCV-PCR反应液的灵敏度检测结果图；

[0026]图3为本发明实施例1中HCV-PCR冻干试剂的灵敏度检测结果图；[0027]图4为本发明实施例2中HIV-1-PCR冻干试剂冻干后的外观；

[0028]图5为本发明实施例2中对照组HIV-1-PCR反应液的灵敏度检测结果图；

[0029]图6为本发明实施例2中HIV-1-PCR冻干试剂的灵敏度检测结果图。

具体实施方式

[0030]下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

[0031]一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂，其包括海藻糖、聚蔗糖和水。

[0032]上述冻干保护剂是将海藻糖6.4～16.0g、聚蔗糖0.4～1.0g混合并加水至40ml 制成的。

[0033]优选地，所述海藻糖与聚蔗糖的配比为16g：1g，加水至40ml。

[0034]具体地，所述聚蔗糖为Ficoll400。

[0035]优选地，所述水为超纯水或不含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的经过DEPC处理的纯净水(即DEPC水)。

[0036]本发明还提供了一种制备如上所述冻干保护剂的方法，其步骤如下：按比例称取海藻糖、聚蔗糖和水，置于容器内混合，然后置于水浴锅内在50～60℃条件下水浴5～15min 使其溶解，混合均匀后小支分装，放入2～8℃冰箱保存即可。

[0037]作为优选，将混合后的海藻糖、聚蔗糖和水置于水浴锅内在60℃条件下水浴10min 使其溶解，混合均匀后小支分装，放入2～8℃冰箱保存，效果更佳。

[0038]本发明还提供了一种RNA扩增反应试剂的冻干方法，其包括以下步骤：

[0039]a、将上述的冻干保护剂与实时荧光RT-PCR反应试剂混合均匀，得到实时荧光RT-PCR反应液；按需要的反应体积，分装至不含脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)的PCR八连管中；

[0040]b、将RT-PCR反应液进行干燥、冻干，冻干完成后往冻干箱内充入干燥空气填充箱体，出箱密封保存即得到RT-PCR冻干试剂制品。

[0041]作为优选，所述步骤a中海藻糖在实时荧光RT-PCR反应液中的终浓度为4～10％，聚蔗糖在实时荧光RT-PCR反应液中的终浓度为0.25～0.625％。

[0042]具体地，所述其中实时荧光RT-PCR反应试剂是一种水溶液，包含如下溶质：Tris·HCl、KCL、(NH4)2·SO4、Mn2+、Tth酶、dNTPs、引物和探针等。

[0043]具体地，所述步骤b中的冻干条件为：预冻阶段经过1h，隔板温度下降到-45±2℃、预冻时低温保持时间为2h；主干燥阶段首先用40min抽真空至0.16mbar、再用60min将隔板温度升至-25±2℃，然后保持4h；解析干燥阶段首先用60～120min抽真空至0.01mbar，再用60～90min将隔板温度升至25±2℃并保持2h，然后用20min将隔板温度升至35℃并保持4h，最后用20min将隔板温度降至25℃并保持2h。

[0044]下面结合实施例1与实施例2对本发明的RNA类荧光定量PCR冻干制品工艺进行详细描述。实施例中所用的海藻糖和聚蔗糖购买于Sigma公司，DEPC水购于韩国Bioneer生物公司。

[0045]实施案例1、HCV荧光定量PCR冻干试剂

[0046]一、5×RT-PCR冻干保护剂的配制

[0047]称取海藻糖16g、Ficoll400 0.4g，加DEPC水至40ml，将以上成分置于康宁离心管瓶混合，置于水浴锅在60℃下水浴10min使其溶解，混合均匀，小支分装，放入2-8℃冰箱保存备用。

[0048]二、HCV荧光定量PCR反应试剂的配制

[0049]HCV反应试剂的配制如下：

[0050]Tth PCR Buffer：1×；

[0051]Tth酶：7.5U；

[0052]HCV pf：400nM；

[0053]HCV pr：400nM；

[0054]HCV pb：100nM；

[0055]RT-PCR冻干保护剂：1×；用水补足50μl。

[0056]含有冻干保护剂的HCV-PCR冻干试剂配制如下：

[0057]

[0058]

[0059]以上各组分颠倒混匀后，按每管50μl分装至PCR八连管中。

[0060]三、HCV荧光定量PCR反应试剂的冻干：

[0061]将装有HCV荧光定量PCR冻干反应试剂的八连管放入冻干机板层上，按照以下程序进行冻干：

[0062]

[0063]冻干完成后取出八连管，封盖待用。HCV-PCR冻干试剂的外观如图1所示。[00]四、将不含保护剂的HCV-PCR反应液(25μl/T)作为对照组，其配制如下：

[0065]

成分×1×110

5×Tth PCR bufffer101100

Tth酶(4.5U/μl) 1.67183.7

UNG酶(5U/μl)0.111

HCV-pf(50μM)0.444

HCV-pr(50μM)0.444

HCV-pb(50μM)0.111

DEPC水12.331356

[0066]以上反应液混匀后使用离心管按每管25μl×17T(425μl)分装为6管，待用。[0067]五、稳定性考核：

[0068]将HCV-PCR冻干试剂分为每16T为一组，共6组；6管HCV-PCR反应液每管为1组：37℃下分别放置0天、3天、7天、10天、15天和20天；分别在每个时间点测试HCV-PCR反应液和HCV-PCR冻干试剂的灵敏度，比较HCV-PCR反应液和加了冻干保护剂的HCV-PCR冻干试剂在稳定性上的差异。

[0069]检测过程如下：

[0070]根据前期实验验证结果发现，HCV液体PCR试剂灵敏度约25IU/ml，因此设置每次试验每组检测25IU/ml、50IU/ml和100IU/ml三个浓度HCV标准品，每个浓度平行检测5份。[0071]1、HCV标准品提取：将用WHO HCV核酸标准品标定过浓度的HCV标准品，用阴性人体血浆稀释至所需浓度，用提取试剂盒进行核酸的纯化，0.2ml样本，60μl洗脱。

[0072]2、加样：按每管HCV-PCR反应液25μl分装至PCR八连管中，再加核酸样本25μl，震荡混匀并瞬间离心后上机；每管HCV-PCR冻干试剂加25μl DEPC水，再加核酸样本25μl，震荡混匀并瞬间离心后上机；

[0073]3、上机：在荧光定量PCR机上设置反应程序如下：

[0074]

[0075]通道选择：FAM

[0076]运行完后，相对法自动分析结果。结果分别如表1和表2所示：

[0077]表1 HCV-PCR反应液灵敏度的稳定性结果

[0078]

HCV标本0天37℃3天37℃7天37℃10天37℃15天37℃20天25IU/ml5/50/50/50/50/50/5

50IU/ml5/52/50/50/50/50/5

100IU/ml5/55/50/50/50/50/5 [0079]表2 HCV-PCR冻干试剂灵敏度的稳定性结果[0080]

[0081]

[0082]由图2～3以及表1～2可知，在第0天时，含有冻干保护剂的HCV-PCR冻干试剂初始灵敏度和HCV-PCR反应液的初始灵敏度一致；随着时间的推移，HCV-PCR反应液在第3天时灵敏度受到明显影响，其37℃稳定性＜3天；而含有冻干保护剂的HCV-PCR冻干试剂在第15天灵敏度未有明显影响，37℃稳定性≥15天。

[0083]实施案例2、HIV-1荧光定量PCR冻干试剂

[0084]一、5×RT-PCR冻干保护剂的配制

[0085]称取海藻糖16g、Ficoll400 0.4g，加DEPC水至40ml，将以上成分置于康宁离心管瓶混合，置于水浴锅在60℃下水浴10min使其溶解，混合均匀，小支分装，放入2-8℃冰箱保存备用。

[0086]二、HIV-1荧光定量PCR反应试剂的配制

[0087]HIV-1反应试剂的配制如下：

[0088]Tth PCR Buffer：1×；

[00]Tth酶：7.5U；

[0090]HIV-1 pf1：400nM；

[0091]HIV-1 pr1：400nM；

[0092]HIV-1 pf2：400nM；

[0093]HIV-1 pr2：400nM；

[0094]HIV-1 pb1：100nM；

[0095]HIV-1 pb2：100nM；

[0096]RT-PCR冻干保护剂：1×；用水补足50μl。

[0097]含有冻干保护剂的HIV-1-PCR冻干试剂配制如下：

[0098]

[0099]将以上各组分颠倒混匀后，按每管50μl分装至PCR八连管中。

[0100]三、HIV-1荧光定量PCR反应试剂的冻干：

[0101]将装有HIV-1荧光定量PCR冻干反应试剂的八连管放入冻干机板层上，按照以下程序进行冻干：

[0102]

[0103]冻干完成后，取出八连管，封盖待用。HIV-1-PCR冻干试剂冻干后的外观如图4所示。

[0104]四、将不含冻干保护剂的HIV-1-PCR反应液(25μl/T)作为对照组，其配制如下：

[0105]

[0106][0107]以上反应液混匀后使用离心管按每管25μl×17T(425μl)分装为6管，待用。[0108]五、稳定性考核：

[0109]将HIV-1-PCR冻干试剂分为每16T为一组，共6组；6管HIV-1-PCR反应液每管为1组：37℃下分别放置0天、3天、7天、10天、15天和20天；分别在每个时间点测试HIV-1-PCR反应液和HIV-1-PCR冻干试剂的灵敏度，比较HIV-1-PCR反应液和加了冻干保护剂的HIV-1-PCR冻干试剂在稳定性上的差异。

[0110]六、检测

[0111]根据前期实验验证结果发现，HIV液体PCR试剂灵敏度约100IU/ml，因此设置每次试验每组检测100IU/ml、400IU/ml和2000IU/ml三个浓度HIV-1标准品，每个浓度平行检测5份。

[0112]1、HIV-1标准品提取：将用WHO HIV-1核酸标准品标定过浓度的HIV-1核酸标准品，用阴性人体血浆稀释至所需浓度，用提取试剂盒进行核酸的纯化，0.2ml样本，60μl洗脱。[0113]2、加样：按每管HIV-1-PCR反应液25μl分装至PCR八连管中，再加核酸样本25μl，震荡混匀并瞬间离心后上机；每管HIV-1-PCR冻干试剂加25μl DEPC水，再加核酸样本25μl，震荡混匀并瞬间离心后上机；

[0114]3、上机：在荧光定量PCR机上设置反应程序如下：

[0115]

[0116]

[0117]通道选择：FAM

[0118]运行完后，相对法自动分析结果。结果如表3、表4所示：

[0119]表3 HIV-1-PCR反应液灵敏度的稳定性结果

[0120]

HIV-1标本0天37℃3天37℃7天37℃10天37℃15天37℃20天

100IU/ml5/51/50/50/50/50/5

400IU/ml5/53/50/50/50/50/5

2000IU/ml5/55/51/50/50/50/5

[0121]表4 HIV-1-PCR反应液灵敏度的稳定性结果

[0122]

HIV-1标本冻干后37℃3天37℃7天37℃10天37℃15天37℃20天100IU/ml5/55/55/55/55/55/5

400IU/ml5/55/55/55/55/55/5

2000IU/ml5/55/55/55/55/55/5[0123]由图5～6以及表3～4可知，在第0天时，含有冻干保护剂的HIV-1-PCR冻干试剂的初始灵敏度和HIV-1-PCR反应液的初始灵敏度一致；随着时间的推移，HIV-1-PCR反应液第3天灵敏度受到明显影响，其37℃稳定性＜3天，37℃10日后全部不能检出；而HIV-1-PCR冻干试剂的在37℃下20天灵敏度未有明显影响，37℃稳定性为≥20天，产品未受影响。[0124]通过实施例1和实施例2可知，两组不含本发明所述冻干保护剂的RNAPCR反应液，在37℃加速破坏条件下稳定性均不足3天，而含此保护剂的相应冻干试剂在37℃加速破坏条件下的稳定性明显可≥15天，显著延长。因此本发明所述的冻干保护剂和冻干方法可以明显提高RNA类PCR反应试剂的稳定性。

[0125]上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

图1

图2

图3

图4图5

图6