植物不同组织可溶性蛋白提取和多肽组分差异研究

方案可行。最好用第二个。

实验目的:

1、掌握冷冻离心机的操作使用方法。

2、掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。

3、掌握分光光度计的使用方法和原理。

4、掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。

5、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。

实验包括三个部分内容：

一、植物不同组织可溶性蛋白的提取。

二、植物可溶性蛋白含量的测定。

三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。

原理:

植物不同组织可溶性蛋白的提取

    植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。将植物材料在一定的提取缓冲液和0～4℃低温下充分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里，通过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。

　离心机基本原理

    ⒈离心力（centrifugal force，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：FC＝mω2X

其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。

⒉相对离心力（relative centrifugal force，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数

RCF＝F离心力/F重力＝ m ω2X/mg=1.118×10－5 . N . X

N（rpm）=RCF×105 /（1.118×X）

    式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；N为转子每分钟的转数（rpm）。

植物细胞破碎后通过差数离心形成的沉淀

考马斯亮蓝 G-250 （ Coomassie brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白质 -染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h ，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比 Lowry 法灵敏 4 倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N ，N —四甲基乙二胺(N，N，N ，N —tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitamin B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的百分数称之为交联度，用C%表示。

T%＝（a+b）×100/m       C%＝b×100/(a+b)

式中  a—Acr的质量（g）； b—Bis的质量（g）；

      m—凝胶溶液总体积（ml）。

在此，a∶b（W/W）是关键；a∶b ＜10时，形成的凝胶脆、硬、呈乳白色；a∶b＞100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易断裂。要制备透明而有弹性的凝胶，a∶b要控制在30左右。通常T = 2%~5%时，a∶b =20左右；T = 5%~10%时，a∶b =40左右；T = 15%~20%时，a∶b =125~200左右。T在3%~25%的范围内，凝胶易发生聚合。

方案一

实验材料：黄豆植物的根、茎、叶

试剂：

1．提取缓冲液：0.125 mol 的Tris-HCl, pH7.0，称取12.5gTris于烧杯，用适量双蒸水溶解，HCl调pH至7.0,定容至1000ml

2．聚乙烯吡咯烷酮（PVP）

3．β-巯基乙醇

4．标准蛋白质溶液（ 100 μg ／ mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白 25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液 40 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。 

5．考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 ，溶于 50 mL 90 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％（ W ／ V ）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。

6．标准蛋白质试剂盒（20次/支）：按使用说明配制

7．胰蛋白酶

8．连续体系SDS—PAGE有关试剂

1）0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液：

称 Na2HPO4·12H2O51.58g及NaH2PO4·2H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容1L。

2) 样品溶解液（上样液）：10ml/组

01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油和0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法见表3-2：

3) 凝胶贮液：

称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶内，4℃贮存可用1—2个月。

4) 凝胶缓冲液：6ml/组

称SDS0.2g，加0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4℃贮存，用前稍加温使SDS溶解。

5) 1%TEMED：

取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4℃贮存。

6) 10%过硫酸铵（AP）：1ml/组

称AP10g，加重蒸水100ml，置棕色瓶内4℃贮存。

7) 电极缓冲液（0.1%SDS，0.1mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液）：

称SDS1克，加500ml0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1L。

8) 2%琼脂（糖）粉：20ml/组

称琼脂（糖）2g，加100ml上述电极缓冲液，4℃贮存。

固定液：

取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。

9. 脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1L。  

设备：冷冻离心机，分光光度计、夹心式垂直板电泳槽（附带凝胶模135×100×1.5mm，1台/组），直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA），研钵，烧杯，量瓶、离心管、试管移液管（1ml×2/组，5ml×1/组，10ml×2/组），烧杯（50ml×3/组），细长头的滴管1只/组，1ml注射器，微量注射器（10或50μL），大培养皿（φ120—160mm×1/组），洗瓶2个/组（分别盛重蒸水、蒸馏水），滤纸一盒，细铜丝（2小段/组），移液管架1个/组

操作步骤：

将黄豆植物清洗干净，准确称取植物材料根、茎、叶各0.5g，加入2ml预冷（0~4℃）的提取缓冲液，0.1g聚乙烯吡咯烷酮PVP和50μl的β-巯基乙醇，置冰浴研磨匀浆后,静置5min，转移到10ml塑料离心管，用3ml提取液分两次洗涤研钵，提取液总体积5ml，10000g下离心10min，上清液为可溶性蛋白的粗提液，分别装入离心试管封口冷冻（0~4℃）保存。

标准曲线的绘制 

取 6 支试管，按下表 加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线

吸取先前提取的可溶性蛋白提取液 0.1 mL （视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复 2－3 次），加入0.9ml蒸馏水，加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置 2 min 后在 595 nm 下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。

样品中的蛋白质含量＝（C×VT）/(VS×WF×1000) （ mg/g ）

式中： C ——查标准曲线值μg 。 VT ——提取液总体积mL 。 

  VS ——测定时加样量 , mL 。WF ——样品鲜重 , g 。

SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳分离植物可溶性蛋白

一、安装夹心式垂直板电泳槽

夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由1个凵形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成。电泳槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃板），下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部分按下列顺序组装：

1）装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。

2）将长、短玻璃板分别插到凵形硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。

3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。

4）将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。

5）竖直电泳槽，用细长头滴管吸取已熔化的2%琼脂（糖）加在长玻璃板下端与硅胶框交界的缝隙内，其目的是封住空隙，加琼脂（糖）溶液时中应避免有气泡。

二、配胶及凝胶板的制备

1. 配胶

根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。表3-3表示配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量（单位/ml）。

2. 凝胶板的制备

按表配制20ml10%浓度的胶，将分离胶混合液直接倒入两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，插入样品槽模板。凝胶聚合约需30min，20—30min后，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可准备加样。

三、加样

加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10—15μL。如果样品槽中有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。将凹槽编号1、2、3、4。1、2、4加提取液，3加标准液。

四、电泳

上槽接负极，下槽接正极，打开电源，将电流调至80mA，待样品进入分离胶后，将电流调至300mA，待染料前沿迁移至距硅胶框底边1—1.5cm处，停止电泳。

五、凝胶板剥离

电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为前沿标记。在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。

六、染色与脱色

先用固定液将凝胶固定1小时，再将染色液倒入培养皿内，染色40min左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。

七、绘制标准曲线

将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）（即染料迁移距离）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm）（即样品迁移距离），如图所示。按下式计算相对迁移率mR：

以标准蛋白质的分子量为纵坐标，对应的相对迁移率为横坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线，根据待测样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。 

方案二：

材料与方法:

1、材料与试剂：新鲜的玉米幼株、提取缓冲液、PVP、β-巯基乙醇、标准蛋白质溶液、考马斯亮蓝G250、考马斯亮蓝R250；标准蛋白试剂盒 、30%的Acr、1%的Bis、10%的AP、1%TEMED、分离胶缓冲贮备液、浓缩胶缓冲贮备液、电极缓冲液、样品溶解缓冲液、固定液、染色液、脱色液 

2、方法：

（Ⅰ）不同植物样品可溶性蛋白的提取

1.将买来的新鲜玉米整株清洗干净，分别剪取玉米的叶片、根、靠近叶片的藤枝。分别准确称取3g植物材料于研钵中，加入10ml预冷的提取缓冲液（Tris缓冲液，Ph7.4），1g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.5ml的β-巯基乙醇，可加入蛋白酶抑止剂（PMSF 苯甲基磺酸氟），置冰浴研磨匀浆，至20分钟。

2、将研磨匀浆转移到塑料离心管并编号，提取液总体积10ml左右。先在4500r/min下离心20min，倾出上清液，并测定溶液体积，然后在10000r／min条件下离心10分钟，用吸管吸取上清液，至容量瓶中，定容至l00ml，并贴上标签。此即为植物不同样品中可溶性蛋白的提取液，

（Ⅱ）可溶性蛋白含量的测定

1、标准曲线的绘制。 

取 6 支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，利用分光光度计在 595 nm 下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

 2、样品测定 

 分别从三种蛋白提取液中测定其中所含蛋白的含量，因此，分别吸取先前提取的可溶性蛋白提取液 1ml，加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置 2 min 后在 595 nm 下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得每种提取液中的蛋白质含量。

（Ⅲ）聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白

1、蛋白质样品的处理。

分别取0.5ml植物可溶性蛋白提取液于试管中，并加入样品溶解液，1:1混合在一起，每种样品都编上号。

2、凝胶及电泳仪的准备

安装好电泳槽后，按附表表格配制浓度为7%的凝胶，配制好的凝胶迅速加入电泳槽的两块玻璃板的缝隙中，并插入梳子，等待凝胶聚合20分钟。

3、加样。

将微量进样器分别吸取之前制好的样品溶解液，按次序插入样槽下部慢慢进样。每槽点样10μg。在另一个样槽中按同样方法加入标准蛋白质样品。

4、电泳（不连续电泳）

上槽接负极，下槽接正级，接通电源，当样品在浓缩胶时电压为80V，进入分离后电压调为120V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿为止。将电流、电压调至零后断电。

5、凝胶板剥离

电泳结束后，取下玻板，揭掉胶布，抽出夹条，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），将胶放入固定液。

6、凝胶的固定、染色和脱色

 将凝胶放入染色液中染色40分钟，然后用蒸馏水冲洗附着于胶面的染料，再将胶浸入脱色液中脱色，更换脱色液几次，直到背景清晰为止

 将脱过色的凝胶照像作为实验报告的凭证。绘制电泳分离示意图，比较分析找到有差异的蛋白条带，并可绘制标准曲线，大致确定条带蛋白质的分子量大小。