国家自然科学基金-成功标书-申请书

申        请        书

一九九七年制

 一、简表

一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写， 申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。

二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。

三、部分栏目填写要求：

    项目名称──应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。

    基础研究──指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。

    应用基础研究──指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。

    申报学科──申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填写主学科。

    申请金额──以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。

    起止年月──起始时间从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的12月。

所用实验室──系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的

              开放实验室。

所在单位名称及代码──按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所” 不得填     

                      “中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：   

                      中国航天工业总公司第七○一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编  

                      入单位代码，其代码暂不填写。

    参加单位数──指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位），以   

             阿拉伯数字表示。

项目组主要成员──指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作    

                  用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。

    研究内容和意义──摘要与主题词均录入软盘。

二、立论依据

（包括项目的和研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）

对基础研究， 着重结合国际科学发展趋势， 论述项目的科学意义;

对应用基础研究， 着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题， 论述其应用前景。

刺梨（Rosa  roxburghii,Tratt）属蔷薇科蔷薇属植物，集中分布于西南地区，在桂西北、湘西、鄂西及陕南等地也有分布。其果实肉脆、甜酸、具浓郁的特殊香味，Vc含量高达2054~3541mg/100g，被誉为水果中的“Vc之王”（朱维藩等，1984）。除鲜食外，更是加工高级饮品的优质原料，尤其是刺梨的防癌、抑癌作用和抗衰老、降血脂、增强免疫力、解铅中毒等保健作用已引起国内外的广泛关注（樊卫国等，1997；Ma et al,1997），与猕猴桃、山楂并誉为我国三大新兴水果（史继孔等，1991）。近年来，贵州省将其列为今后培育的产业经济之一，在西部开发的大潮中，亦将其作为特色产业来开发。自上世纪80年代以来，经几代果树科研人员的辛勤耕耘,贵州选育出一些优良株系（朱维藩等，1984；向显衡等，1987），有的已直接用于大面积生产，产生了较大的经济效益。先后有20多个省市从贵州引种，在部分地区建立了生产基地。1815年，刺梨由传教士Roxburgh经印度引入欧洲，因其果实表面有刺，形同板栗的总苞而被称为栗玫瑰（Chestnut rose），在欧洲及美国等地将其作为观赏植物来培植(Fangan, 1988)。近年来的研究表明，刺梨对玫瑰的黑斑病（Blackspot）具有免疫能力，在玫瑰抗病育种中倍受青睐(Wiggers et al, 1997)。

但是在刺梨的人工栽培中，白粉病（S phaerotheca ）为害严重，主要表现为4~6月为害刺梨的嫩叶和花果，造成叶片和花果脱落（庞纯翠等，1986）。经过20多年的选育工作，获得了一个对白粉病高抗的株系（待发表），这一珍贵的种质资源为培育刺梨的白粉病抗性品种及直接分离抗性基因提供了物质基础。不幸的是，迄今为止对刺梨的遗传基础研究极为薄弱。

过去人们对植物抗病基因的结构和功能缺乏认识，只能依赖图位克隆（Map-based cloning/Positional cloning）或转座子标签技术(Transposon tagging)对植物抗病基因进行克隆，并在一些一年生植物上得到成功应用(董继新等，2001)。但多拷贝基因的存在以及插入位点的随机性极大地了转座子标签法的应用范围（Dixon et al,1996），同时木本植物很难获得转座子突变体。图位克隆法是近些年来发展起来的另一种有效方法，但高密度的分子标记遗传图谱是该方法不可逾越的一道鸿沟，目前的应用仅限于基因组较小的一些模式植物。

近年来，随着分子生物学和基因克隆技术的发展，对一些抗性基因的分子特性有了新的认识（Baker et al, 1997;Hammond-Kosack et al ,1997;董继新等，2001），从而在一定程度上促进了基因的分离和克隆研究。利用同源序列克隆技术（Homology-based cloning）已成功地分离出小麦叶锈病抗性基因Lr10（Fenillet ，1997）及拟南芥白粉病的广谱抗性基因RPW8（Xiao et al, 2001）。剖析已克隆的20余例植物抗病基因，发现大多数抗病基因编码的蛋白质都含有核苷酸结合位点（Nucleotide bindign site, NBS)和亮氨酸富集重复序列（Leucine-rich repeat，LRR）结构域（董继新等，2001；郑先武等，2001；Deng et al,2000），如拟南芥Rps2、 Rpm1、 Rpp5基因，番茄Prf 和I2基因，亚麻的L6和M6基因，烟草的N基因等（Mindrinos et al, 1994; Whitham et al, 1994;Hammond-Kosack et al ,1997）。诸多研究显示，以这些保守氨基酸序列设计简并引物对进行PCR扩增，获得的部分抗病候选基因（Resistance gene candidate，RGC）或抗病基因类似物(Resistance gene analog，RGA)和已知的病毒、细菌、真菌或线虫抗性基因位点紧密连锁，有的甚至就来自于抗性基因（郑先武等，2001；Kanazin et al,1996; Shen et al ,1998; Speulman et al ,1998; Deng et al, 2000）。这不仅预示了植物抗病基因抗病的可能机理，也为抗病基因的克隆提供了新途径（Hammond-Kosack et al ,1997)，特别是对于生命周期长，遗传上高度杂合，遗传背景知之甚少的果树，基于这些保守结构域的同源序列克隆法已引起学术界的极大兴趣（Deng et al, 2000）。

采用同源序列法克隆抗病候选基因，有很多成功的报道。Leister等（1996）根据拟南芥的抗病基因RPS2和烟草的抗病基因N的高度保守的LRR序列设计引物，对马铃薯基因组DNA进行PCR扩增，获得了与已知抗病基因同源、与抗线虫病基因Grol和抗晚疫病基因R7完全连锁的DNA片段。Yu等（1996）根据烟草N和拟南芥RPS2基因编码蛋白质的NBS同源序列设计简并引物，从大豆中克隆出11类含NBS序列的片段，其中5个定位于已知的抗病基因附近；贺英超等（2001）以抗花叶病毒的大豆品种为试材，基于大多数抗病基因的NBS-LRR保守区域的特点，设计特异简并引物对，克隆出与大豆抗花叶病毒基因Rsa位于同一连锁群的KNSB2序列，经Northern检测，KNSB2在大豆的根、茎和叶中为低丰度的组成型表达。同样，以NBS-LRR结构设计的简并引物对，从水稻中克隆出了大小约520bp的片段，通过序列比较分析发现，其编码产物属于抗病基因同源序列，并发现其中一个来自抗白叶枯病基因家族（郑先武等，2001）。在水稻及禾本科的其他作物上，也开展了卓有成效的工作(薛永彪等，1998；Spielmeyer et al, 1998)。迄今为止，基于抗病基因的NBS-LRR结构域而采用同源序列法克隆RGC的一年生作物还有大麦（Seah et al,1998）、小麦(薛永彪等，1998；Seah et al,1998)、菜豆(Creusot et al, 1999)、莴苣（Shen et al, 1998）和番茄(Ohmori et al,1998)等。但是应该看到，该方法在多年生作物上报道很少，仅在柑桔上，Deng等人（2000）取得了较大进展，克隆出39个RGC，部分RGC和抗柑桔速衰病（Ctv）及柑桔线虫抗性基因(Tyr1)紧密连锁，为发展柑桔抗病基因分子标记和全基因的克隆奠定了坚实基础。因此，基于NBS-LRR的同源序列法获得的RGC，不但可发展为植物抗病基因的更精确定位的分子标记，而且有可能广泛应用于包括多年生果树在内的其他作物抗病基因的克隆策略中（(薛永彪等，1998；Hammond-Kosack et al ,1997;Speulman et al，1998；Deng et al, 2000）。

抗病性状分子标记的遗传分析，通常采用近等位基因系（Near-isogenic lines,NILs）为试材，但对包括木本植物在内的绝大多数植物，要获得近等位基因系非常困难。为此，Michelmore等(1991)开发了集团分离体分析法（Bulked segregant analysis, BSA），其作法为以F2代群体为材料，按目标性状的表现（如抗病性强弱），挑选出两个极端类型组成两个基因池（Bulks or Pools），每个池内的目标性状一致而不管其它性状的表现，这样两个基因池分子标记的多态性既与用于构建基因池的目标性状连锁。该方法也可应用于数量性状研究（Ling et al, 2000）。但是，对生长周期长、树体高大、很多种类自交不育的果树来说，要构建F2代群体绝非易事，目前仅在桃上有采用F2代进行BSA的报道（Chaparro et al, 1994）。实际上，绝大多数果树栽培品种为杂合体，许多基因位点都会在自交或杂交中分离，采用双亲都为高度杂合的品种或株系杂交，其杂交一代性状分离复杂，产生双假测交（Double pseudotest cross）现象，利用其F1代群体，应用BSA法可以直接进行果树的基因定位（卢江，1995）。该方法已在苹果、柑桔等遗传背景复杂的多年生果树上得到成功应用（Deng et al,2000)。

在植物白粉病抗性基因的克隆上，前人取得了很大进展。Buschges等（1997）采用图位克隆法分离出大麦白粉病抗性基因Mlo；Xiao等（2001）采用同源序列法分离出拟南芥白粉病广谱抗性基因RPW8；而通过NBS设计简并引物的策略，在大豆上克隆出与大豆白粉病抗性连锁的2类共7个候选基因，为基因的全序列克隆奠定了基础(Yu et al, 1996)。这表明，基于NBS-LRR的同源序列法有可能分离出植物的白粉病RGC。

本研究拟以刺梨白粉病抗性株系为试材，采用大多数植物抗病基因所具有的NBS-LRR结构特征，设计特异简并引物对进行PCR，分离和克隆候选基因。同源序列克隆与BSA结合应用，可以在不知道遗传背景和没有遗传、物理图谱的情况下开展刺梨白粉病抗性基因的克隆工作。通过刺梨的白粉病高抗和极感株系的杂交后代，采用BSA法，由此确定克隆出的RGC与刺梨白粉病抗性的遗传关系。并以与刺梨白粉病抗病紧密连锁或共分离的RGC转化为探针，筛选文库，以期获得完整的基因。课题的实施，对刺梨白粉病抗性候选基因的获得，分子标记辅助选择抗病类型具有重大意义，并为最终获得完整的抗病基因及进一步开展重要性状的遗传定位奠定坚实的物质和技术基础。

主  要  参  考  文  献

1. 朱维藩等，1984，贵州的刺梨资源及其生长发育、Vc含量同生态条件关系的调查究。贵州农学院丛刊，3：1~13。

2. 庞纯翠等，1986， 刺梨白粉病的发生、发展极其防治的研究。贵州农学院丛刊，8：35~38。

3. 向显衡等，1987，贵州省刺梨种质资源利用研究。中国水土保持，7：34~35。

4. 卢江，1995，基因定位极其在园艺作物遗传育种中的应用。园艺学年评，1：165~179。科学出版社。

5 史继孔等，1991，我国刺梨研究进展。贵州农学院学报,10(2)：88~94。

6. 樊卫国等，1997，贵州省刺梨资源开发利用及对策。西南农业学报，10（3）：109~115。

7. 薛永彪等，1998，水稻基因组中R类抗病基因同源序列的分离。科学通报，43（3）：277~281。

8. 贺超英等，2001，大豆中NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定。科学通报，46（12）：1017~1021。

9. 董继新等，2001，植物抗病基因研究进展。植物病理学报，31（1）：1~9。

10.郑先武等，2001，水稻NBS-LRR类R基因同源序列。中国科学（C辑），31（1）：43~51。

Baker B et al, 1997, Signaling in plant-microbe interactions. Science, 276: 726~733.

Chaparro J K, 1994, Targeted mapping and linkage analysis of morphological isozyme, and RAPD markers in peach. Theor Appl Genet, 87: 805~815.

Creusot F et al, 1999, Cloning and molecular characterization of three members of the NBS-LRR subfamily located in the vicinity of the Co-2 locus for anthracnose resistance in Phaseolus vulgaris. Genome, 42:254~2.

Deng Z et al, 2000, Cloning and characterization of NBS-LRR class resistance-gene candidate sequences in citrus. Theor Appl Genet, 101: 814~822.

Dixon M S et al, 1996, The tomato CF-2 disease resistance locus comprises two functional genes encoding leucine-rich repeat proteins[J]. Cell, 84: 451~459. 

Fagan G, 1988, Roses At The Cape Of Good Hope. Breestraat-Publikasies, Cape Town, South Africa, 1988, pp. 210-211.

Fenillet C, 1997, Molecular cloning of a new receptor-like kinase gene encoded at the Lr10 disease resistance locus of wheat. The Plant J.,11: 45~52.

Hammond-Kosack K E, 1997, Plant disease resistance genes. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Bio 48: 575~607. 

Kanazin V, 1996, Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybean.  Proc Natl Acad Sci USA, 93: 11746~11750.

Leister D,1996, A PCR-based approach for isolating pathogen resistance genes from potato with potential for wide application in plants. Nature Genet, 13: 421~429. Theor Appl Genet, 100:1010~1017.

Ling P et al, 2000, Inheritance of citrus nematode resistance and its linkage with molecular markers. 

Ma Y X et al , 1997, The aging retarding effect of 'Long-Life CiLi'. Mechanisms of Ageing and Development, 96, 171-1.

Michelmore R W et al,1991, Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc Natl Acad Sci USA, 88: 9828~9832. 

Mindrinos M, 1994, The A. thaliana disease resistance gene RPS2 encodes a protein containing a nucleotide-binding site and leucine-rich repeat. Cell, 78: 10~1099.

Ohmori T et al, 1998,Characterization of disease resistance gene-like sequences in near-isogenic lines of tomato. Theor Appl Genet, 96: 331~338.

Seah S et al, 1998, Cloning and characterization of three members of a family of disease resistance gene analogs from wheat and barley. Theor Appl Genet, 97: 937~945.

Shen K A, 1998, Resistance gene candidates identified by PCR with degenerate oligonucleotide primers map to clusters of resistance genes in lettuce. Mol Plant-Microbe Interact, 11: 815~823.

Speulman E et al, 1998, Disease resistance gene homologs correlate with disease resistance loci of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 14(4): 467~474.

Spielmeyer W, 1998, A superfamily of disease resistance gene analogs is located on all homoeologous chromosome groups of wheat. Genome, 41(6): 782~788.

Whitham S et al, 1994, The  product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to toll and the interleukin-1 receptor. Cell, 78: 1101~1115.

Wiggers R J et al, 1997, Conidial germination and infection by Diplocarpon rosae on susceptible and resistant rose species. Mycologia, (1): 103-108 .

Xiao S et al, 2001, Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science, 291(5501):118~120.

三、研究方案

1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

 研究目标：

（1）克隆30条左右后选基因片段，测定其DNA序列；

  （2）确定克隆出的后选基因与白粉病抗性的关系；

  （3）建立刺梨细菌人工染色体（BAC）文库；

  （4）利用后选基因片段筛选BAC文库，获得后选抗病基因的全长序列。

 研究内容

（1）根据植物抗病基因编码蛋白质的保守结构域NBS-LRR，设计简并引物对；

（2）寻找、扩增、克隆与抗病基因有关的DNA片段；

（3）克隆的测序，与已知抗病基因序列进行比较分析，剖析所获片段的可能特性；

（4）以扩增片段为探针，对亲本及F1代进行RLFP分析，运用“双假测交”原理，采用BSA方法，确定RGC与白粉病抗性的遗传关系；

（5）刺梨BAC文库的构建；

（6）从文库中筛选含抗病基因的克隆。

拟解决的关键问题

（1）刺梨特异PCR实验体系的建立；

（2）特异简并引物对的筛选、特异扩增带的寻找、回收和克隆；

（3）RGC与已知抗病基因的比较分析；

（4）RGC与刺梨白粉病抗性遗传关系的确定；

（5）刺梨BAC文库的构建，抗病基因克隆的筛选。

2. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

  研究方法和实验方案

  （1）特异引物对的设计  根据已知抗病基因编码蛋白质的NBS-LRR保守结构域，设计特异简并引物对。对白粉病高抗和感病株系的DNA进行PCR扩增，找出特异带；

  （2）特异片段的克隆  对高抗株系DNA进行PCR扩增，回收特异带，然后对其进行连接并转化到感受态的大肠杆菌上，获得转化的克隆储藏备用；

  （3）克隆的测序和序列分析  将获得的克隆进行测序，然后通过GeneBank和其他已知的抗病基因进行对比，并通过蛋白质序列分析软件包ANTHEPROT（Version 5.0）进行蛋白质结构预测和特性分析，粗选出可能的后选基因；

  （4）遗传相关性分析  以高抗类型、极感病类型及其F1代遗传群体为试材, 按抗性的大小，将F1代群体里的极端类型（高抗和极感类型）标出，连同双亲共4个类型。每个类型10株左右，取相同量的叶片混合后抽提DNA，构建基因池。再将回收出的后选基因片段转成探针，对上述基因池DNA进行RFLP分析，根据“双假测交”原理，采用BSA方法，确定片断和白粉病抗性的遗传关系；

（5）刺梨基因组的BAC文库的构建 

  （6）文库筛选：以通过检验的与抗病相关的扩增片段制备探针，采用高密度菌落原位杂交法筛选刺梨的BAC文库，将阳性的BAC克隆进行亚克隆，并将亚克隆再与扩增产物杂交，获得阳性亚克隆。

  （7）亚克隆序列分析  将阳性亚克隆有选择地进行测序，并与其他植物已分离抗病基因进行比较分析，研究抗病基因在不同植物中的结构差异及进化关系。将分离到的部分亚克隆连接到植物表达载体上，为鉴定候选基因的功能（抗病性）及转化感病品种奠定基础。

技术路线流程：

可行性分析

本研究旨在以刺梨白粉病抗性株系为试材，采用植物大部分抗病基因编码蛋白质所具有的NBS-LRR保守结构域，设计特异简并引物对进行PCR，分离和克隆抗病候选基因。这种方法已在拟南芥、水稻、大豆、小麦、番茄及柑桔等植物中得到成功应用。

同源序列克隆与BSA结合应用，可以在不知道遗传背景和没有遗传、物理图谱的情况下开展刺梨白粉病抗性基因的克隆工作。同时通过刺梨的白粉病高抗和极感株系杂交产生的后代，运用“双假测交”原理，采用BSA法，确定克隆出的RGC与刺梨白粉病抗性的遗传关系。申请人已在“作物遗传改良国家重点实验室”从事了两年的分子生物学研究工作，并已获得了F1代杂交种子，课题一旦获得立项，其分子生物学研究内容将在国家重点实验室进行，申请小组已具备课题顺利实施的物质和技术基础。

3．课题的创新之处

图位克隆和转座子标签法费时长且极为昂贵，在木本植物上尚未见成功的报道。刺梨遗传基础研究十分薄弱，但杂交座果率高、种子多，建立遗传群体相对容易。申请小组拟采用大部分已知抗病基因所共有的NBS-LRR保守结构域设计特异简并引物对，通过PCR扩增，可以在缺少遗传、物理图谱的情况下，对我国珍稀果树——刺梨进行白粉病抗性候选基因的克隆。

同源序列克隆与BSA相结合，可以找出与白粉病抗性紧密连锁或共分离的后选基因，然后再通过筛选BAC文库可望克隆全长的基因；同时，该连锁关系的确定还将为刺梨遗传图谱的进一步构建奠定基础。

4. 年度研究计划及预测进展

 2003年

   (1) 以NBA-LRR设计简并引物，进行特异PCR，特异带的回收及克隆，测序及序列分析；

   (2) BAC文库的构建；

   (3) 基因池的构建及DNA的分离。

2004年

  (1) 以回收片段为探针进行RLFP分析；

   (2) 采用BSA法分析克隆片段与抗病性的遗传关系；

 文库筛选，获得阳性克隆。

2005年

 (1) 亚克隆，测序及序列的比较分析；

 (2) 植物表达载体的构建；

 (3) 论文撰写及课题的鉴定验收。

5. 预期研究成果

（1）克隆出刺梨白粉病抗性后选基因；

  （2）确定与刺梨白粉病抗性连锁或共分离的分子标记；

  （3）建立刺梨BAC文库；

（4）表达质粒载体的构建；

1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩

从2001年2月起，在国家自然科学基金其他项目和贵州省自然科学基金的资助下，申请小组借助“作物遗传改良国家重点实验室” （依托单位：华中农业大学）的实验条件，已开展了一年多的前期工作，取得了以下进展：

（1）建立起刺梨及其近缘种的DNA分离技术及RAPD实验体系；

（2）完成了刺梨及其近缘种的RAPD分析，刺梨主要栽培类型RAPD指纹图谱的构建，并撰写论文一篇，已投Euphytica；

（3）通过高抗类型和重感类型的有性杂交，获得了F1代种子；

（4）建立起刺梨特异PCR实验体系；完成了简并引物对设计，引物对筛选及特异带的寻找工作；

（5）初步完成了特异带的回收，获得了部分克隆；

（6）申请小组已具备该项目顺利实施的技术储备。

2. 已具备的实验条件， 尚缺少的实验条件和拟解决的途径 (包括利用国家重点实验室和部开放实验室的计划与落实情况) 

申请人从1999年起，在“作物遗传改良国家重点实验室”攻读在职博士学位。申请项目一旦立项，全部分子生物学工作将在“作物遗传改良国家重点实验室”开展，实验室拥有较好的分子生物学实验条件和技术平台，无须添置大型仪器设备就能保证项目的顺利实施。

 专著：作者·书名·出版者·年份

五、经费预算

六、申请者正在承担的其他研究项目

(攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况)

我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。

申请者（签章）

年 月 日

九、推荐意见

（不具有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究条件等，项目组成员不能做推荐者）

十、申请者所在单位及合作单位的审查与保证

已对申请书内容进行了审核，同意学术委员会的审查意见并保证在项目获得后做到以下几点：

（1）保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予支持

（2）严格遵守科学基金委员会有关资助项目管理、财务等各项规定

（3）督促项目负责人和本单位项目管理部门按科学基金委员会的规定及时报送有关报表和材料

 需要说明的其他问题：无