镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤

1、        过柱前的注意事项：

a、        样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；

b、        包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME；

c、        确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争；

2、        过Ni柱的操作步骤：

a、用去离子水洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；

b、5×柱体积的Charge Buffer（50mM NiSO4）充电；

c、5×柱体积的去离子水洗涤，去游离的Ni离子；

d、        10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡；

e、        上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）；

f、        20×柱体积的Washing Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20-50mM咪唑，pH8.0）洗涤，至无蛋白检出，收集流出液；

g、        Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）；

h、        10×柱体积的Binding Buffer洗涤。此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需要重新充电。

注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。

3、柱的清洗与保存：

a、去Ni离子：a、5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤；b、10×柱体积的去离子水洗涤。

b、去沉淀的蛋白质：a、5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；b、去离子水洗涤，至流出液的pH值为7。

c、保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。